Enmolekylär avbildning av EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA
Summary
Här beskriver vi användningen av den enmolekylära avbildningsmetoden, DNA-gardiner, för att studera den biofysiska mekanismen för EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA.
Abstract
Fusionsgenerna som härrör från kromosomal translokation har hittats i många solida tumörer eller leukemi. EWS-FLI1, som tillhör FUS / EWS / TAF15 (FET) -familjen av fusionsonkoproteiner, är en av de mest involverade fusionsgenerna i Ewing sarkom. Dessa FET-familjefusionsproteiner har vanligtvis en lågkomplexitetsdomän (LCD) av FET-protein vid deras N-terminal och en DNA-bindande domän (DBD) vid deras C-terminal. EWS-FLI1 har bekräftats bilda biomolekylära kondensat vid dess målbindande loci på grund av LCD-LCD och LCD-DBD-interaktioner, och dessa kondensat kan rekrytera RNA-polymeras II för att förbättra gentranskriptionen. Hur dessa kondensat monteras på sina bindningsställen är dock fortfarande oklart. Nyligen tillämpades en enmolekylär biofysikmetod-DNA-gardiner-för att visualisera dessa monteringsprocesser av EWS-FLI1-kondensat. Här diskuteras det detaljerade experimentella protokollet och dataanalysmetoderna för tillämpning av DNA-gardiner för att studera de biomolekylära kondensaten som monteras på mål-DNA.
Introduction
Transkriptionell reglering är ett avgörande steg för exakt genuttryck i levande celler. Många faktorer, såsom kromosommodifiering, transkriptionsfaktorer (TF) och icke-kodande RNA, deltar i denna komplicerade process 1,2,3. Bland dessa faktorer bidrar TF till specificiteten av transkriptionell reglering genom att känna igen och binda till specifika DNA-sekvenser som kallas promotorer eller förstärkare och därefter rekrytera andra funktionella proteiner för att aktivera eller undertrycka transkription 4,5,6,7. Hur dessa TFs lyckas söka efter sina målplatser i det mänskliga genomet och interagera med DNA belagt med histoner och icke-histon DNA-bindande proteiner har förvirrat forskare i årtionden. Under de senaste åren har flera klassiska modeller för målsökningsmekanismen för TFs byggts för att beskriva hur de “glider”, “hoppar”, “hoppar” eller “intersegmentöverföring” längs DNA-kedjan 8,9,10,11. Dessa modeller är inriktade på sökbeteendet på DNA från en enda TF-molekyl. Nya studier visar dock att vissa TF genomgår vätske-vätskefasseparation (LLPS) antingen ensam i kärnan eller med Mediator-komplexet12. De observerade dropparna av TF är associerade med promotorn eller förstärkarregionerna, vilket belyser rollen för biomolekylär kondensatbildning vid transkription och det tredimensionella genomet13,14,15. Dessa biomolekylära kondensat är kopplade till membranbristfack in vivo och in vitro. De bildas via LLPS, där modulära biomakromolekyler och inneboende oordnade regioner (IDR) av proteiner är två huvudsakliga drivkrafter för multivalenta interaktioner16. Således söker TF inte bara DNA utan fungerar också synergistiskt inom dessa kondensat 4,17,18. Hittills är den biofysiska egenskapen hos dessa transkriptionskondensat på DNA fortfarande oklar.
Därför syftade denna studie till att tillämpa en enmolekylär metod-DNA-gardiner-för att direkt avbilda bildandet och dynamiken hos transkriptionskondensaten som bildas av TF på DNA in vitro. DNA Curtains, en in vitro-bildplattform med hög genomströmning för att studera interaktionen mellan proteiner och DNA, har applicerats i DNA-reparation19,20,21, målsökning 22 och LLPS17,23,24. Flödescellen i DNA-gardiner är belagd med biotinylerade lipid-dubbelskikt för att passivera ytan och låta biomolekylerna diffundera på ytan. De nanofabricerade sicksackmönstren begränsar DNA-rörelsen. Biotinylerade Lambda DNA-substrat kan rikta sig längs barriärkanterna och sträckas ut av det orienterade buffertflödet. Samma start- och slutsekvenser av alla molekyler möjliggör spårning av proteinet på DNA och beskriver positionsfördelningen av bindningshändelserna25,26. Dessutom hjälper kombinationen av DNA-gardiner med total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) att minimera bakgrundsbruset och detektera signaler på en enda molekylnivå. Således kan DNA-gardiner vara en lovande metod för att undersöka dynamiken i transkriptionskondensatbildning på DNA-motiv. Detta dokument beskriver exemplet på en FUS / EWS / TAF15 (FET) familj fusion onkoprotein, EWS-FLI1, genererad av kromosomal translokation. Lambda-DNA innehållande 25× GGAA-bindningssekvensen för EWS-FLI127– användes som DNA-substrat i DNA-gardinerna för att observera hur EWS-FLI1-molekyler genomgår LLPS på DNA. Detta manuskript diskuterar det experimentella protokollet och dataanalysmetoderna i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom enmolekylära metoder är extremt känsliga för innehållet i reaktionssystemet, måste extra ansträngning investeras för att säkerställa god kvalitet på alla material och lösningar under DNA-gardinerna, särskilt de lipider som framställts i sektionerna 1 och 2 och de buffertar som används i avsnitt 5. Reagenser av högre renhet måste användas för att framställa buffertar, och buffertar måste vara nyberedda för enmolekylanalysen
När 500 nM mCherry-märkt EWS-FLI1 spol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
- Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
- Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
- Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
- Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
- Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
- Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
- Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
- Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
- Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
- Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
- Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing’s sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
- Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
- Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).
- Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).
