Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN
Summary
Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.
Abstract
Los genes de fusión resultantes de la translocación cromosómica se han encontrado en muchos tumores sólidos o leucemia. EWS-FLI1, que pertenece a la familia de oncoproteínas de fusión FUS/EWS/TAF15 (FET), es uno de los genes de fusión más frecuentemente involucrados en el sarcoma de Ewing. Estas proteínas de fusión de la familia FET típicamente albergan un dominio de baja complejidad (LCD) de proteína FET en su extremo N y un dominio de unión al ADN (DBD) en su extremo C. Se ha confirmado que EWS-FLI1 forma condensados biomoleculares en sus loci de unión objetivo debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, y estos condensados pueden reclutar ARN polimerasa II para mejorar la transcripción génica. Sin embargo, no está claro cómo se ensamblan estos condensados en sus sitios de unión. Recientemente, se aplicó un método biofísico de una sola molécula, DNA Curtains, para visualizar estos procesos de ensamblaje de condensados EWS-FLI1. Aquí, se discuten el protocolo experimental detallado y los enfoques de análisis de datos para la aplicación de cortinas de ADN en el estudio de los condensados biomoleculares que se ensamblan en el ADN objetivo.
Introduction
La regulación transcripcional es un paso crucial para la expresión génica precisa en las células vivas. Muchos factores, como la modificación cromosómica, los factores de transcripción (TF) y los ARN no codificantes, participan en este complicado proceso 1,2,3. Entre estos factores, los TF contribuyen a la especificidad de la regulación transcripcional al reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN conocidas como promotores o potenciadores y posteriormente reclutar otras proteínas funcionales para activar o reprimir la transcripción 4,5,6,7. La forma en que estos TF logran buscar sus sitios objetivo en el genoma humano e interactuar con el ADN recubierto con histonas y proteínas de unión al ADN no histonas ha dejado perplejos a los científicos durante décadas. En los últimos años, se han construido varios modelos clásicos para el mecanismo de búsqueda de objetivos de los TF para describir cómo se “deslizan”, “saltan”, “saltan” o “transfieren intersegmentos” a lo largo de la cadena de ADN 8,9,10,11. Estos modelos se centran en el comportamiento de búsqueda en el ADN de una sola molécula de TF. Sin embargo, estudios recientes muestran que algunos TF se someten a separación de fase líquido-líquido (LLPS) ya sea solos en el núcleo o con el complejo mediador12. Las gotitas observadas de TFs están asociadas con las regiones promotoras o potenciadoras, destacando el papel de la formación de condensado biomolecular en la transcripción y el genoma tridimensional13,14,15. Estos condensados biomoleculares están vinculados a compartimentos carentes de membrana in vivo e in vitro. Se forman a través de LLPS, en el que las biomacromoléculas modulares y las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) de proteínas son dos fuerzas impulsoras principales de las interacciones multivalentes16. Así, los TF no sólo buscan ADN, sino que también funcionan sinérgicamente dentro de estos condensados 4,17,18. Hasta la fecha, la propiedad biofísica de estos condensados de transcripción en el ADN sigue sin estar clara.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo aplicar un método de molécula única, DNA Curtains, para obtener imágenes directas de la formación y dinámica de los condensados de transcripción formados por TF en ADN in vitro. DNA Curtains, una plataforma de imágenes in vitro de alto rendimiento para estudiar la interacción entre las proteínas y el ADN, se ha aplicado en la reparación del ADN 19,20,21, la búsqueda de objetivos22 y LLPS 17,23,24. La célula de flujo de las cortinas de ADN está recubierta con bicapas lipídicas biotiniladas para pasivar la superficie y permitir que las biomoléculas se difundan en la superficie. Los patrones en zigzag nanofabricados limitan el movimiento del ADN. Los sustratos de ADN lambda biotinilados pueden alinearse a lo largo de los bordes de la barrera y ser estirados por el flujo de amortiguación orientado. Las mismas secuencias inicial y final de todas las moléculas permiten el seguimiento de la proteína en el ADN y describen la distribución de la posición de los eventos de unión25,26. Además, la combinación de cortinas de ADN con microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) ayuda a minimizar el ruido de fondo y detectar señales a nivel de molécula única. Por lo tanto, las cortinas de ADN podrían ser un método prometedor para investigar la dinámica de la formación de condensado de transcripción en motivos de ADN. Este artículo describe el ejemplo de una oncoproteína de fusión de la familia FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, generada por translocación cromosómica. El ADN lambda que contiene 25× GGAA, la secuencia de unión de EWS-FLI127, se utilizó como sustrato de ADN en los experimentos DNA Curtains para observar cómo las moléculas EWS-FLI1 se someten a LLPS en el ADN. Este manuscrito discute el protocolo experimental y los métodos de análisis de datos en detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como los enfoques de una sola molécula son extremadamente sensibles al contenido del sistema de reacción, se debe invertir un esfuerzo adicional para garantizar la buena calidad de todos los materiales y soluciones durante los experimentos de cortinas de ADN, especialmente los lípidos preparados en las secciones 1 y 2 y los tampones utilizados en la sección 5. Se deben usar reactivos de mayor pureza para preparar tampones, y los tampones deben estar recién preparados para el ensayo de molécula única.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
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