Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA
Summary
Aqui, descrevemos o uso do método de imagem de molécula única, Cortinas de DNA, para estudar o mecanismo biofísico dos condensados EWS-FLI1 que se reúnem no DNA.
Abstract
Os genes de fusão resultantes da translocação cromossômica foram encontrados em muitos tumores sólidos ou leucemia. EWS-FLI1, que pertence à família FUS/EWS/TAF15 (FET) de oncoproteínas de fusão, é um dos genes de fusão mais frequentemente envolvidos no sarcoma de Ewing. Essas proteínas de fusão da família FET tipicamente abrigam um domínio de baixa complexidade (LCD) da proteína FET em seu terminal N e um domínio de ligação ao DNA (DBD) em seu terminal C. Foi confirmado que o EWS-FLI1 forma condensados biomoleculares em seus loci de ligação alvo devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, e esses condensados podem recrutar RNA polimerase II para melhorar a transcrição gênica. No entanto, como esses condensados são montados em seus locais de ligação ainda não está claro. Recentemente, um método biofísico de molécula única – Cortinas de DNA – foi aplicado para visualizar esses processos de montagem de condensados EWS-FLI1. Aqui, o protocolo experimental detalhado e as abordagens de análise de dados são discutidos para a aplicação de cortinas de DNA no estudo dos condensados biomoleculares que se reúnem no DNA alvo.
Introduction
A regulação transcricional é um passo crucial para a expressão gênica precisa em células vivas. Muitos fatores, como modificação cromossômica, fatores de transcrição (FTs) e RNAs não codificantes, participam desse complicado processo 1,2,3. Dentre esses fatores, os FTs contribuem para a especificidade da regulação transcricional, reconhecendo e ligando-se a sequências específicas de DNA conhecidas como promotores ou potenciadores e, posteriormente, recrutando outras proteínas funcionais para ativar ou reprimir a transcrição 4,5,6,7. Como esses TFs conseguem procurar seus locais-alvo no genoma humano e interagir com o DNA revestido com histonas e proteínas não vinculadoras de DNA de histonas tem deixado os cientistas perplexos há décadas. Nos últimos anos, vários modelos clássicos para o mecanismo de busca de alvos de FTs foram construídos para descrever como eles “deslizam”, “saltam”, “saltam” ou “transferem entre segmentos” ao longo da cadeia de DNA 8,9,10,11. Esses modelos são focados no comportamento de busca no DNA de uma única molécula de FT. No entanto, estudos recentes mostram que alguns FTs sofrem separação de fase líquido-líquido (LLPS) isoladamente no núcleo ou com o complexo Mediador12. As gotículas observadas dos FTs estão associadas às regiões promotoras ou potenciadoras, destacando o papel da formação de condensado biomolecular na transcrição e no genoma tridimensional13,14,15. Estes condensados biomoleculares estão ligados a compartimentos sem membrana in vivo e in vitro. Elas são formadas via LLPS, na qual biomacromoléculas modulares e regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) de proteínas são duas das principais forças motrizes das interações multivalentes16. Assim, os FTs não apenas buscam o DNA, mas também funcionam sinergicamente dentro desses condensados 4,17,18. Até o momento, a propriedade biofísica desses condensados de transcrição no DNA permanece obscura.
Portanto, este trabalho teve como objetivo aplicar um método de molécula única – Cortinas de DNA – para visualizar diretamente a formação e a dinâmica dos condensados de transcrição formados por TFs no DNA in vitro. DNA Curtains, uma plataforma de imagem in vitro de alto rendimento para estudar a interação entre proteínas e DNA, tem sido aplicada no reparo de DNA 19,20,21, busca de alvos22 e LLPS17,23,24. A célula de fluxo das cortinas de DNA é revestida com bicamadas lipídicas biotiniladas para passivar a superfície e permitir que as biomoléculas se difundam na superfície. Os padrões de zigue-zague nanofabricados limitam o movimento do DNA. Os substratos de DNA Lambda biotinilados podem se alinhar ao longo das bordas da barreira e ser esticados pelo fluxo tampão orientado. As mesmas sequências inicial e final de todas as moléculas permitem o rastreamento da proteína no DNA e descrevem a distribuição de posição dos eventos de ligação25,26. Além disso, a combinação de cortinas de DNA com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) ajuda a minimizar o ruído de fundo e detectar sinais em um nível de molécula única. Assim, as cortinas de DNA podem ser um método promissor para investigar a dinâmica da formação de condensado de transcrição em motivos de DNA. Este artigo descreve o exemplo de uma oncoproteína de fusão da família FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, gerada por translocação cromossômica. DNA lambda contendo 25× GGAA – a sequência de ligação do EWS-FLI127 – foi usado como substrato de DNA nos experimentos de DNA Curtains para observar como as moléculas EWS-FLI1 sofrem LLPS no DNA. Este manuscrito discute detalhadamente o protocolo experimental e os métodos de análise de dados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como as abordagens de molécula única são extremamente sensíveis ao conteúdo do sistema de reação, um esforço extra deve ser investido para garantir a boa qualidade de todos os materiais e soluções durante os experimentos de cortinas de DNA, especialmente os lipídios preparados nas seções 1 e 2 e os tampões usados na seção 5. Reagentes de maior pureza devem ser usados para preparar tampões, e os tampões devem ser preparados recentemente para o ensaio de molécula única
Quando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
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