DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징
Summary
여기에서는 DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 생물물리학적 메커니즘을 연구하기 위해 단일 분자 이미징 방법인 DNA 커튼의 사용에 대해 설명합니다.
Abstract
염색체 전좌로 인한 융합 유전자는 많은 고형 종양 또는 백혈병에서 발견되었습니다. 융합 종양 단백질의 FUS / EWS / TAF15 (FET) 계열에 속하는 EWS-FLI1은 유잉 육종에서 가장 자주 관여하는 융합 유전자 중 하나입니다. 이러한 FET 패밀리 융합 단백질은 일반적으로 N-말단에 FET 단백질의 저복잡성 도메인(LCD)을, C-말단에 DNA 결합 도메인(DBD)을 가지고 있습니다. EWS-FLI1은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 표적 결합 유전자좌에서 생체 분자 축합 물을 형성하는 것으로 확인되었으며, 이러한 축합 물은 RNA 중합 효소 II를 모집하여 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이러한 응축수가 결합 부위에서 어떻게 조립되는지는 불분명합니다. 최근에는 EWS-FLI1 응축물의 이러한 조립 과정을 시각화하기 위해 단일 분자 생물 물리학 방법인 DNA 커튼이 적용되었습니다. 여기에서는 표적 DNA에 조립되는 생체 분자 응축수를 연구하는 데 DNA 커튼을 적용하기 위한 상세한 실험 프로토콜 및 데이터 분석 접근 방식에 대해 논의합니다.
Introduction
전사 조절은 살아있는 세포에서 정확한 유전자 발현을 위한 중요한 단계입니다. 염색체 변형, 전사 인자(TF) 및 비코딩 RNA와 같은 많은 요인이 이복잡한 과정에 참여합니다1,2,3. 이러한 요인 중 TF는 프로모터 또는 인핸서로 알려진 특정 DNA 서열을 인식하고 결합한 다음 전사 4,5,6,7을 활성화하거나 억제하기 위해 다른 기능성 단백질을 모집함으로써 전사 조절의 특이성에 기여합니다. 이러한 TF가 인간 게놈에서 표적 부위를 검색하고 히스톤 및 비 히스톤 DNA 결합 단백질로 코팅 된 DNA와 상호 작용하는 방법은 수십 년 동안 과학자들을 당혹스럽게했습니다. 지난 몇 년 동안, TF의 표적 검색 메커니즘에 대한 몇 가지 고전적인 모델이 DNA 사슬 8,9,10,11을 따라 “미끄러지는”, “홉”, “점프”또는 “세그먼트 간 전달”하는 방법을 설명하기 위해 구축되었습니다. 이 모델은 단일 TF 분자의 DNA에 대한 검색 행동에 중점을 둡니다. 그러나 최근 연구에 따르면 일부 TF는 핵에서 단독으로 또는 매개체 복합체12와 함께 액체-액체 상 분리 (LLPS)를 겪습니다. TF의 관찰된 액적은 프로모터 또는 인핸서 영역과 연관되어, 전사 및 3차원 게놈13,14,15에서 생체분자 축합물 형성의 역할을 강조한다. 이러한 생체 분자 응축수는 생체 내 및 시험관 내에서 막이 없는 구획과 연결되어 있습니다. 이들은 LLPS를 통해 형성되며, 여기서 모듈식 생체 거대분자와 단백질의 내재적으로 무질서한 영역(IDR)은 다가 상호 작용의 두 가지 주요 원동력입니다16. 따라서 TF는 DNA를 검색 할뿐만 아니라 이러한 응축수 4,17,18 내에서 상승 작용을합니다. 현재까지 DNA에 대한 이러한 전사 응축 물의 생물 물리학 적 특성은 불분명하다.
따라서 이 연구는 단일 분자 방법인 DNA 커튼을 적용하여 시험관 내 DNA에서 TF에 의해 형성된 전사 응축물의 형성과 역학을 직접 이미지화하는 것을 목표로 했습니다. 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 연구하기 위한 고처리량 체외 이미징 플랫폼인 DNA 커튼은 DNA 복구 19,20,21, 표적 검색 22 및 LLPS17,23,24에 적용되었습니다. DNA 커튼의 플로우 셀은 바이오 티닐화 지질 이중층으로 코팅되어 표면을 부동 태화하고 생체 분자가 표면에 확산되도록합니다. 나노 가공 된 지그재그 패턴은 DNA의 움직임을 제한합니다. 비오틴화된 람다 DNA 기질은 장벽 가장자리를 따라 정렬될 수 있으며 배향된 완충액 흐름에 의해 늘어날 수 있습니다. 모든 분자의 동일한 시작 및 끝 서열은 DNA 상의 단백질의 추적을 허용하고 결합 이벤트(25, 26)의 위치 분포를 설명한다. 또한 DNA 커튼과 전반사 형광 현미경(TIRFM)의 조합은 배경 노이즈를 최소화하고 단일 분자 수준에서 신호를 감지하는 데 도움이 됩니다. 따라서 DNA 커튼은 DNA 모티프에서 전사 응축수 형성의 역학을 조사하는 유망한 방법이 될 수 있습니다. 이 논문은 염색체 전좌에 의해 생성된 FUS/EWS/TAF15(FET) 패밀리 융합 종양단백질, EWS-FLI1의 예를 설명합니다. EWS-FLI1의 결합 서열인 25× GGAA를 함유하는 람다 DNA27-를 DNA 커튼 실험에서 DNA 기질로 사용하여 EWS-FLI1 분자가 DNA에서 LLPS를 겪는 방식을 관찰하였다. 이 원고는 실험 프로토콜 및 데이터 분석 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 분자 접근법은 반응 시스템의 내용물에 매우 민감하기 때문에 DNA 커튼 실험 중에 모든 물질과 용액, 특히 섹션 1과 2에서 준비된 지질과 섹션 5에서 사용된 완충액의 우수한 품질을 보장하기 위해 추가 노력을 투자해야 합니다. 완충액을 준비하려면 더 높은 순도의 시약을 사용해야 하며, 완충액은 단일 분자 분석을 위해 새로 준비해야 합니다.
500 nM mCherry-표지된 EWS-FLI1을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NSFC 보조금 번호 31670762 (Z.Q.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
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