Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA
Summary
Hier beschrijven we het gebruik van de single-molecule beeldvormingsmethode, DNA Curtains, om het biofysische mechanisme van EWS-FLI1-condensaten te bestuderen die zich op DNA assembleren.
Abstract
De fusiegenen die het gevolg zijn van chromosomale translocatie zijn gevonden in veel solide tumoren of leukemie. EWS-FLI1, dat behoort tot de FUS/EWS/TAF15 (FET) familie van fusie-oncoproteïnen, is een van de meest betrokken fusiegenen in Ewing-sarcoom. Deze FET-familie fusie-eiwitten herbergen meestal een laagcomplex domein (LCD) van FET-eiwit op hun N-terminus en een DNA-bindend domein (DBD) op hun C-terminus. Ews-FLI1 is bevestigd biomoleculaire condensaten te vormen op zijn doelbindingsloci als gevolg van LCD-LCD- en LCD-DBD-interacties, en deze condensaten kunnen RNA-polymerase II rekruteren om de gentranscriptie te verbeteren. Hoe deze condensaten op hun bindingsplaatsen worden geassembleerd, blijft echter onduidelijk. Onlangs werd een biofysicamethode met één molecuul – DNA Curtains – toegepast om deze assemblageprocessen van EWS-FLI1-condensaten te visualiseren. Hier worden de gedetailleerde experimentele protocol- en data-analysebenaderingen besproken voor de toepassing van DNA-gordijnen bij het bestuderen van de biomoleculaire condensaten die zich op doel-DNA assembleren.
Introduction
Transcriptionele regulatie is een cruciale stap voor nauwkeurige genexpressie in levende cellen. Veel factoren, zoals chromosomale modificatie, transcriptiefactoren (TF’s) en niet-coderende RNA’s, nemen deel aan dit gecompliceerde proces 1,2,3. Onder deze factoren dragen TF’s bij aan de specificiteit van transcriptionele regulatie door specifieke DNA-sequenties die bekend staan als promotors of versterkers te herkennen en vervolgens andere functionele eiwitten te rekruteren om transcriptie 4,5,6,7 te activeren of te onderdrukken. Hoe deze TF’s erin slagen om naar hun doellocaties in het menselijk genoom te zoeken en te interageren met DNA bedekt met histonen en niet-histon DNA-bindende eiwitten, heeft wetenschappers decennialang verbijsterd. In de afgelopen jaren zijn verschillende klassieke modellen voor het doelzoekmechanisme van TF’s gebouwd om te beschrijven hoe ze “schuiven”, “hoppen”, “springen” of “intersegmentoverdracht” langs de DNA-keten 8,9,10,11. Deze modellen zijn gericht op het zoekgedrag op het DNA van één enkel TF-molecuul. Recente studies tonen echter aan dat sommige TF’s vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) ondergaan, hetzij alleen in de kern, hetzij met het Mediator-complex12. De waargenomen druppeltjes van TF’s zijn geassocieerd met de promotor- of enhancerregio’s, wat de rol van biomoleculaire condensaatvorming in transcriptie en het driedimensionale genoom 13,14,15 benadrukt. Deze biomoleculaire condensaten zijn gekoppeld aan membraan-ontbrekende compartimenten in vivo en in vitro. Ze worden gevormd via LLPS, waarbij modulaire biomacromolecules en intrinsiek ongeordende regio’s (IDR’s) van eiwitten twee belangrijke drijvende krachten zijn van multivalente interacties16. Tf’s zoeken dus niet alleen DNA, maar functioneren ook synergetisch binnen deze condensaten 4,17,18. Tot op heden blijft de biofysische eigenschap van deze transcriptiecondensaten op DNA onduidelijk.
Daarom was deze studie gericht op het toepassen van een single-molecule methode – DNA Curtains – om de vorming en dynamiek van de transcriptiecondensaten gevormd door TF’s op DNA in vitro direct in beeld te brengen. DNA Curtains, een high-throughput in vitro beeldvormingsplatform om de interactie tussen eiwitten en DNA te bestuderen, is toegepast in DNA-reparatie 19,20,21, target search22 en LLPS 17,23,24. De flowcel van DNA Curtains is bedekt met gebiotinyleerde lipide bilayers om het oppervlak te passiveren en de biomoleculen op het oppervlak te laten diffunderen. De nanogefabriceerde zigzagpatronen beperken de beweging van DNA. Gebiotinyleerde Lambda DNA-substraten kunnen langs de barrièreranden worden uitgelijnd en worden uitgerekt door de georiënteerde bufferstroom. Dezelfde begin- en eindsequenties van alle moleculen maken het mogelijk om het eiwit op DNA te volgen en beschrijven de positieverdeling van de bindingsgebeurtenissen25,26. Bovendien helpt de combinatie van DNA-gordijnen met totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) de achtergrondruis te minimaliseren en signalen op één molecuulniveau te detecteren. DNA Curtains zou dus een veelbelovende methode kunnen zijn om de dynamiek van transcriptiecondensaatvorming op DNA-motieven te onderzoeken. Dit artikel beschrijft het voorbeeld van een FUS/EWS/TAF15 (FET) familiefusie oncoproteïne, EWS-FLI1, gegenereerd door chromosomale translocatie. Lambda-DNA met 25× GGAA – de bindingssequentie van EWS-FLI127 – werd gebruikt als dna-substraat in de DNA Curtains-experimenten om te observeren hoe EWS-FLI1-moleculen LLPS ondergaan op DNA. Dit manuscript bespreekt het experimentele protocol en de methoden voor gegevensanalyse in detail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aangezien benaderingen met één molecuul uiterst gevoelig zijn voor de inhoud van het reactiesysteem, moet extra inspanning worden geleverd om een goede kwaliteit van alle materialen en oplossingen te garanderen tijdens de DNA Curtains-experimenten, met name de lipiden die zijn bereid in secties 1 en 2 en de buffers die in sectie 5 worden gebruikt. Reagentia met een hogere zuiverheidsgraad moeten worden gebruikt om buffers te bereiden en buffers moeten vers worden bereid voor de bepaling met één molecuul
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
- Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
- Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
- Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
- Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
- Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
- Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
- Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
- Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
- Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
- Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
- Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing’s sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
- Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
- Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).
- Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).
