माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाओं में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का मूल्यांकन बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके
Summary
यहां प्रस्तुत विधि गैर-अनुयायी माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल को सारांशित करती है, जो वास्तविक समय में एचएसपीसी की बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) को मापने के लिए बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करती है।
Abstract
स्थिर स्थिति के तहत, हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) काफी हद तक क्विसेंट रहते हैं और माना जाता है कि वे अपनी ऊर्जावान जरूरतों को पूरा करने के लिए मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस पर निर्भर हैं। हालांकि, संक्रमण या रक्त की हानि जैसी तनाव की स्थिति में, एचएससी प्रोलिफेरेटिव बन जाते हैं और तेजी से डाउनस्ट्रीम पूर्वज कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं, जो बदले में आगे अंतर करते हैं, अंततः परिपक्व रक्त कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। इस संक्रमण और भेदभाव प्रक्रिया के दौरान, एचएससी क्विसेंस से बाहर निकलते हैं और तेजी से ग्लाइकोलाइसिस से ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ऑक्सफॉस) तक एक चयापचय स्विच से गुजरते हैं। विभिन्न तनाव की स्थिति, जैसे कि उम्र बढ़ने, कैंसर, मधुमेह और मोटापा, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं और इस प्रकार हेमटोपोइसिस के दौरान एचएससी और पूर्वजों के चयापचय रीप्रोग्रामिंग और भेदभाव को बदल सकते हैं। सामान्य और तनाव की स्थिति में एचएससी और पूर्वजों के ग्लाइकोलाइटिक और माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि को उनकी बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के मूल्यांकन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जो क्रमशः सेलुलर ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक हैं।
यहां, माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न वंश-नकारात्मक सेल आबादी में ईसीएआर और ओसीआर को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है, जिसमें हेमटोपोइएटिक स्टेम और आदिम पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) दोनों शामिल हैं, जो बाहरी फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करते हैं। यह प्रोटोकॉल माउस अस्थि मज्जा से वंश-नकारात्मक कोशिकाओं को अलग करने के दृष्टिकोण का वर्णन करता है, सेल सीडिंग घनत्व और 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज (2-डीजी, एक ग्लूकोज एनालॉग जो ग्लाइकोलाइसिस को रोकता है) और विभिन्न ऑक्सएफओएस-लक्षित दवाओं (ओलिगोमाइसिन, एफसीसीपी, रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए) के अनुकूलन की व्याख्या करता है, और इन assays में उपयोग की जाने वाली दवा उपचार रणनीतियों का वर्णन करता है। ग्लाइकोलाइटिक फ्लक्स के प्रमुख पैरामीटर, जैसे कि ग्लाइकोलाइसिस, ग्लाइकोलाइटिक क्षमता, और ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व, और ऑक्सफॉस पैरामीटर, जैसे बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, एटीपी उत्पादन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता और युग्मन दक्षता, इन assays में मापा जा सकता है। यह प्रोटोकॉल गैर-अनुयायी HSPCs पर ECAR और OCR माप की अनुमति देता है और किसी भी प्रकार के निलंबन कोशिकाओं के लिए विश्लेषण शर्तों को अनुकूलित करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।
Introduction
हेमटोपोइसिस वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा एचएससी1 से अत्यधिक विशिष्ट कार्यों के साथ विभिन्न प्रकार की परिपक्व रक्त कोशिकाएं बनती हैं। एचएससी विभिन्न बहु-शक्तिशाली और वंश-विशिष्ट पूर्वज आबादी में आत्म-नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम हैं। ये पूर्वज अंततः लिम्फोइड, माइलॉयड, एथेरॉइड और मेगाकैरियोसाइट्स वंशों की कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता को बनाए रखने के लिए, एचएससी काफी हद तक क्विसेंट रहते हैं और, अन्य ऊतक स्टेम कोशिकाओं की तरह, माना जाता है कि एटीपी उत्पादन 2,3 के लिए माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सएफओएस के बजाय ग्लाइकोलाइसिस पर भरोसा करते हैं। सेल चक्र में प्रवेश से श्वसन और ऑक्सएफओएस में वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का ऊंचा स्तर होता है, जो एचएससी रखरखाव और कार्य3 के लिए हानिकारक हैं। इस प्रकार बार-बार सेल विभाजन एचएससी की आत्म-नवीकरण क्षमता को कम कर सकता है और अंततः उनकी थकावट के लिए।
वयस्क हेमटोपोइसिस में, एचएससी मुख्य रूप से असममित सेल विभाजन से गुजरते हैं, जिसके दौरान बेटी कोशिकाओं में से एक एचएससी क्षमता को बनाए रखता है और ग्लाइकोलाइटिक चयापचय पर भरोसा करना जारी रखता है। दूसरी बेटी कोशिका एक आदिम पूर्वज कोशिका बन जाती है जो आत्म-नवीकरण क्षमता खो देती है लेकिन फैलती है और अंततः विभेदित कार्यात्मक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को जन्म देतीहै। जब एचएससी डाउनस्ट्रीम पूर्वजों का उत्पादन करने के लिए अंतर करते हैं, तो ग्लाइकोलाइसिस से माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय तक एक स्विच को इस तेजी से संक्रमण5 का समर्थन करने के लिए आवश्यक ऊर्जा और बिल्डिंग ब्लॉकों की आपूर्ति करने के लिए माना जाता है, जैसा कि टिप्पणियों द्वारा सुझाव दिया गया है कि एचएससी के पास निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान 6,7,8,9 है। . इसके विपरीत, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि (लिंक्ड आरओएस स्तरों द्वारा इंगित) एचएससी 9,10,11 की तुलना में वंश-प्रतिबद्ध पूर्वजों में बहुत अधिक है। मेटाबोलिक परिवर्तन जो हेमेटोपोइसिस के शुरुआती चरण के दौरान होते हैं, इस प्रकार एचएससी भाग्य को विनियमित करने में माइटोकॉन्ड्रिया की प्रत्यक्ष और महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देते हैं।
विभिन्न तनाव स्थितियों के तहत मौजूद बेकार माइटोकॉन्ड्रिया, जैसे कि उम्र बढ़ने, कैंसर, मधुमेह और मोटापा12, एचएससी आत्म-नवीकरण क्षमता में हस्तक्षेप कर सकते हैं, आरओएस की अत्यधिक मात्रा का उत्पादन करके एचएससी / पूर्वज भेदभाव में असंतुलन को प्रेरित कर सकते हैं, एटीपी उत्पादन को खराब कर सकते हैं, और / या अन्य चयापचय प्रक्रियाओं को बदलकर 9,12,13 . एचएससी / पूर्वज भेदभाव में चयापचय होमियोस्टैसिस में गड़बड़ी हेमटोपोइसिस को काफी प्रभावित कर सकती है, संभावित रूप से हेमेटोलॉजिकल असामान्यताओं के विकास में योगदानदे सकती है। एचएससी स्टेमनेस और भेदभाव पर ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सएफओएस के महत्वपूर्ण प्रभावों को देखते हुए, सामान्य और तनाव की स्थिति में चयापचय दोनों मापदंडों की जांच करना दिलचस्पी है। एचएससी और पूर्वज कोशिकाओं के ग्लाइकोलाइटिक और माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि उनके ईसीएआर और ओसीआर का आकलन करके प्राप्त की जा सकती है, जो क्रमशः सेलुलर ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के संकेतक हैं।
Seahorse extracellular flux analyzer एक शक्तिशाली उपकरण है जो लाइव कोशिकाओं में ECAR और OCR को एक साथ मापने के लिए प्रति अच्छी तरह से दो जांच से सुसज्जित है और इस प्रकार इसका उपयोग विभिन्न सब्सट्रेट या अवरोधकों के जवाब में वास्तविक समय में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। परख कारतूस विश्लेषक के साथ इस्तेमाल किया इंजेक्शन बंदरगाहों को परख के दौरान स्वचालित इंजेक्शन के लिए चार दवाओं को पकड़ने के लिए शामिल हैं. एक विशिष्ट ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण की एक योजना को चित्र 1 ए में दिखाया गया है। परख कोशिकाओं के ECAR के माप के साथ शुरू होता है, ग्लूटामाइन युक्त ग्लाइकोलिसिस तनाव परीक्षण माध्यम में incubated लेकिन ग्लूकोज या पाइरूवेट नहीं। यह कोशिकाओं की गैर-ग्लाइकोलाइटिक गतिविधियों के कारण होने वाले अम्लीकरण का प्रतिनिधित्व करता है और इसे गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। इसके बाद संतृप्त एकाग्रता पर ग्लूकोज का इंजेक्शन लगाया जाता है। ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से, सेल में ग्लूकोज को पाइरूवेट में परिवर्तित किया जाता है, जिसे आगे लैक्टेट का उत्पादन करने के लिए साइटोप्लाज्म में चयापचय किया जाता है, या माइटोकॉन्ड्रिया में सीओ2 और पानी का उत्पादन करने के लिए।
लैक्टेट में ग्लूकोज का रूपांतरण शुद्ध उत्पादन और बाद में प्रोटॉन को बाह्य कोशिकीय माध्यम में जारी करने का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप ईसीएआर 14,15,16 में तेजी से वृद्धि होती है। ईसीएआर में इस ग्लूकोज-प्रेरित परिवर्तन को बेसल स्थितियों के तहत ग्लाइकोलाइसिस के रूप में रिपोर्ट किया गया है। दूसरे इंजेक्शन में ओलिगोमाइसिन (एटीपी सिंथेज़ का एक अवरोधक, उर्फ जटिल वी17) होता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन को रोकता है। ओलिगोमाइसिन-मध्यस्थता वाले ऑक्सएफओएस निषेध के दौरान, कोशिकाएं अपनी ऊर्जावान मांगों को पूरा करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस को अधिकतम रूप से नियंत्रित करती हैं। यह ईसीएआर में एक और वृद्धि का कारण बनता है, जिससे कोशिकाओं की अधिकतम ग्लाइकोलाइटिक क्षमता का पता चलता है। अधिकतम ग्लाइकोलाइटिक क्षमता और बेसल ग्लाइकोलाइसिस के बीच के अंतर को ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व के रूप में जाना जाता है। अंत में, 2-डीजी इंजेक्ट किया जाता है, जो ईसीएआर में एक महत्वपूर्ण गिरावट का कारण बनता है, आमतौर पर गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण के स्तर के करीब होता है। 2-डीजी एक ग्लूकोज एनालॉग है जो प्रतिस्पर्धात्मक रूप से हेक्सोकिनेज को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप ग्लाइकोलाइसिस18 का निषेध होता है। इस प्रकार, ईसीएआर में 2-डीजी-प्रेरित कमी आगे पुष्टि करती है कि ग्लाइकोलाइसिस वास्तव में ग्लूकोज और ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद देखे गए ईसीएआर का स्रोत है।
चित्रा 1 बी एक विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण के लिए योजनाबद्ध प्रदर्शित करता है। परख कोशिकाओं के बेसलाइन ओसीआर माप के साथ शुरू होता है, ग्लूकोज, ग्लूटामाइन, और पाइरूवेट युक्त माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण माध्यम में इनक्यूबेट किया जाता है। बेसल ओसीआर माप के बाद, ओलिगोमाइसिन को इस परख में इंजेक्ट किया जाता है, जो जटिल वी को रोकता है, जिससे इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) 17 के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह कम हो जाता है। नतीजतन, ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के जवाब में ओसीआर कम हो जाता है, और ओसीआर में यह कमी माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन से जुड़ी होती है। दूसरे इंजेक्शन में कार्बोनिल साइनाइड -4 (ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी), एक प्रोटोनोफोर और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सएफओएस17 का एक अनकपलर शामिल है। FCCP माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में प्रोटॉन के प्रवाह की अनुमति देकर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटॉन ग्रेडिएंट को ध्वस्त कर देता है। FCCP इंजेक्शन के कारण, ETC के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह derepressed है, और जटिल IV अधिकतम स्तर पर ऑक्सीजन की खपत करता है। अधिकतम ओसीआर और बेसल ओसीआर के बीच के अंतर को अतिरिक्त श्वसन क्षमता के रूप में जाना जाता है, जो तनाव की स्थिति में बढ़ी हुई ऊर्जा मांग का जवाब देने के लिए सेल की क्षमता का एक उपाय है। अंत में, दो ईटीसी अवरोधकों (रोटेनोन, एक जटिल आई अवरोधक, और एंटीमाइसिन ए, एक जटिल III अवरोधक17) का मिश्रण इंजेक्ट किया जाता है, जो इलेक्ट्रॉन प्रवाह को पूरी तरह से बंद कर देता है, और ओसीआर कम स्तर तक कम हो जाता है। Rotenone और antimycin के बाद मापा गया OCR एक इंजेक्शन कोशिकाओं के अंदर अन्य प्रक्रियाओं द्वारा संचालित गैर-माइटोकॉन्ड्रियल OCR से मेल खाता है। गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर बेसल श्वसन, प्रोटॉन रिसाव और अधिकतम श्वसन की गणना को सक्षम बनाता है।
बेसल श्वसन बेसलाइन ओसीआर और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर के बीच अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। प्रोटॉन रिसाव ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर के बाद ओसीआर के बीच के अंतर को संदर्भित करता है। अधिकतम श्वसन एफसीसीपी इंजेक्शन और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर के बाद ओसीआर के बीच के अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। युग्मन दक्षता की गणना बेसल श्वसन दर के लिए एटीपी उत्पादन दर के प्रतिशत के रूप में की जाती है। यह विधि पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है ECAR और OCR वंश-नकारात्मक HSPCs में Seahorse XFe96 extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर मापने के लिए। यह प्रोटोकॉल माउस वंश-नकारात्मक एचएसपीसी को अलग करने के दृष्टिकोण का वर्णन करता है, सेल-सीडिंग घनत्व के अनुकूलन और बाह्य कोशिकीय फ्लक्स एसेस में उपयोग की जाने वाली विभिन्न दवाओं की सांद्रता की व्याख्या करता है, और दवा उपचार रणनीतियों का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह विधि पत्र सीहोर्स एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके माउस एचएसपीसी में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स (ग्लाइकोलाइसिस और ऑक्सएफओएस) के मूल्यांकन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लोम्बार्ड प्रयोगशाला में काम एनआईएच (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044, और ME200030) और चिकित्सा अनुसंधान के लिए ग्लेन फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। ली प्रयोगशाला में काम एनआईएच (NHLBI 5R01HL150707) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
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