Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator
Summary
De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC’s) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC’s in realtime te meten.
Abstract
Onder steady state blijven hematopoëtische stamcellen (HSC’s) grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse om aan hun energetische behoeften te voldoen. Onder stressomstandigheden zoals infectie of bloedverlies worden HSC’s echter proliferatief en produceren ze snel stroomafwaartse voorlopercellen, die op hun beurt verder differentiëren en uiteindelijk volwassen bloedcellen produceren. Tijdens dit overgangs- en differentiatieproces verlaten HSC’s rust en ondergaan ze snel een metabole omschakeling van glycolyse naar oxidatieve fosforylering (OxPHOS). Verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas, kunnen de mitochondriale functie negatief beïnvloeden en kunnen dus de metabole herprogrammering en differentiatie van HSC’s en voorlopercellen tijdens hematopoëse veranderen. Waardevolle inzichten in glycolytische en mitochondriale functies van HSC’s en voorlopercellen onder normale en stressomstandigheden kunnen worden verkregen door de beoordeling van hun extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR), die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling.
Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om ECAR en OCR te meten in van het beenmerg afgeleide afstammingsnegatieve celpopulaties van muizen, die zowel hematopoëtische stam als primitieve voorlopercellen (HSPC’s) omvatten, met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van afstammingsneg-negatieve cellen uit het beenmerg van muizen, verklaart optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van 2-deoxy-D-glucose (2-DG, een glucose-analoog dat glycolyse remt) en verschillende OxPHOS-gerichte geneesmiddelen (oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A) die in deze testen worden gebruikt, en beschrijft behandelingsstrategieën voor geneesmiddelen. Belangrijke parameters van glycolytische flux, zoals glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserve, en OxPHOS-parameters, zoals basale ademhaling, maximale ademhaling, protonlek, ATP-productie, reserve ademhalingscapaciteit en koppelingsefficiëntie, kunnen in deze testen worden gemeten. Dit protocol maakt ECAR- en OCR-metingen op niet-adherente HSPC’s mogelijk en kan worden gegeneraliseerd om de analyseomstandigheden voor elk type suspensiecellen te optimaliseren.
Introduction
Hematopoiese is het proces waarbij verschillende soorten volwassen bloedcellen met zeer gespecialiseerde functies worden gevormd uit HSC’s1. HSC’s zijn in staat tot zelfvernieuwing en differentiatie in verschillende multipotente en afstammingsspecifieke voorloperpopulaties. Deze voorlopers produceren uiteindelijk cellen van lymfoïde, myeloïde, erytroïde en megakaryocytenlijnen. Om hun zelfvernieuwingscapaciteit te behouden, blijven HSC’s grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze, net als andere weefselstamcellen, afhankelijk zijn van glycolyse in plaats van mitochondriaal OxPHOS voor ATP-productie 2,3. Toegang tot de celcyclus leidt tot verbeterde ademhaling en OxPHOS, wat resulteert in verhoogde niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die schadelijk zijn voor HSC-onderhoud en -functie3. Herhaalde celdeling kan dus leiden tot een verminderd zelfvernieuwend vermogen van HSC’s en uiteindelijk tot uitputting ervan.
Bij volwassen hematopoiese ondergaan HSC’s voornamelijk asymmetrische celdeling, waarbij een van de dochtercellen HSC-potentieel behoudt en blijft vertrouwen op glycolytisch metabolisme. De andere dochtercel wordt een primitieve voorlopercel die zelfvernieuwingsvermogen verliest maar zich vermenigvuldigt en uiteindelijk aanleiding geeft tot gedifferentieerde functionele hematopoëtische cellen4. Wanneer HSC’s differentiëren om stroomafwaartse voorlopers te produceren, wordt gedacht dat een omschakeling van glycolyse naar mitochondriaal metabolisme plaatsvindt om de energie en bouwstenen te leveren die nodig zijn om deze snelle overgang te ondersteunen5, zoals gesuggereerd door de observaties dat HSC’s inactieve mitochondriale massa bezitten 6,7,8,9 . Daarentegen is mitochondriale activiteit (aangegeven door gekoppelde ROS-niveaus) veel hoger in afstammingsgebonden voorlopers dan in HSC’s 9,10,11. Metabole veranderingen die optreden tijdens de vroegste stap van hematopoëse suggereren dus een directe en cruciale rol van mitochondriën bij het reguleren van het lot van HSC.
Disfunctionele mitochondriën die aanwezig zijn onder verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas12, kunnen het zelfvernieuwingsvermogen van HSC verstoren, waardoor een onbalans in HSC / voorloperdifferentiatie wordt veroorzaakt door overmatige hoeveelheden ROS te produceren, de ATP-productie te verminderen en / of door andere metabole processen te veranderen 9,12,13 . Verstoringen in metabole homeostase in HSC/voorloper differentiatie kunnen een significante invloed hebben op de hematopoëse, wat mogelijk bijdraagt aan de ontwikkeling van hematologische afwijkingen13. Gezien de kritische invloeden van glycolyse en mitochondriaal OxPHOS op HSC-stengelheid en differentiatie, is het van belang om zowel metabole parameters onder normale als stressomstandigheden te onderzoeken. Waardevolle inzichten in de glycolytische en mitochondriale functie van HSC’s en voorlopercellen kunnen worden verkregen door hun ECAR en OCR te beoordelen, die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling.
De Seahorse extracellulaire flux analyzer is een krachtig apparaat uitgerust met twee sondes per put om tegelijkertijd ECAR en OCR in levende cellen te meten en kan dus worden gebruikt om cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen, in reactie op verschillende substraten of remmers. De testcartridge die met de analysator wordt gebruikt, bevat injectiepoorten om maximaal vier geneesmiddelen voor geautomatiseerde injectie tijdens de test te houden. Een schema van een typische glycolyse stresstest is weergegeven in figuur 1A. De test begint met het meten van ECAR van cellen, geïncubeerd in glycolyse stresstestmedium dat glutamine bevat, maar geen glucose of pyruvaat. Dit vertegenwoordigt verzuring die optreedt als gevolg van niet-glycolytische activiteiten van de cellen en wordt gerapporteerd als niet-glycolytische verzuring. Dit wordt gevolgd door de injectie van glucose in een verzadigingsconcentratie. Via glycolyse wordt glucose in de cel omgezet in pyruvaat, dat verder wordt gemetaboliseerd in het cytoplasma om lactaat te produceren, of in mitochondriën om CO2 en water te produceren.
Omzetting van glucose in lactaat veroorzaakt nettoproductie en daaropvolgende afgifte van protonen in het extracellulaire medium, wat resulteert in een snelle toename van de ECAR 14,15,16. Deze glucose-gestimuleerde verandering in ECAR wordt gerapporteerd als glycolyse onder basale omstandigheden. De tweede injectie bestaat uit oligomycine (een remmer van ATP-synthase, ook bekend als complex V17), dat de mitochondriale ATP-productie remt. Tijdens oligomycine-gemedieerde OxPHOS-remming upreguleren cellen de glycolyse maximaal om aan hun energetische eisen te voldoen. Dit veroorzaakt een verdere toename van ECAR, waardoor de maximale glycolytische capaciteit van de cellen wordt onthuld. Het verschil tussen de maximale glycolytische capaciteit en basale glycolyse wordt glycolytische reserve genoemd. Ten slotte wordt 2-DG geïnjecteerd, wat een aanzienlijke daling van de ECAR veroorzaakt, meestal dicht bij niet-glycolytische verzuringsniveaus. 2-DG is een glucose-analoog dat concurrerend bindt aan hexokinase, wat resulteert in remming van glycolyse18. De door 2 DG geïnduceerde afname van ECAR bevestigt dus verder dat glycolyse inderdaad de bron is van ECAR waargenomen na glucose- en oligomycine-injecties.
Figuur 1B toont het schema voor een typische mitochondriale stresstest. De test begint met baseline OCR-meting van de cellen, geïncubeerd in mitochondriaal stresstestmedium dat glucose, glutamine en pyruvaat bevat. Na basale OCR-metingen wordt oligomycine geïnjecteerd in deze test, die complexe V remt, waardoor de elektronenstroom door de elektronentransportketen (ETC)17 wordt verminderd. Bijgevolg wordt OCR verminderd als reactie op oligomycine-injectie en deze afname van OCR is gekoppeld aan mitochondriale ATP-productie. De tweede injectie bestaat uit carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), een protonofoor en een ontkoppelaar van mitochondriaal OxPHOS17. FCCP stort de mitochondriale protongradiënt in door de stroom van protonen over het mitochondriale binnenmembraan mogelijk te maken. Door de FCCP-injectie wordt de elektronenstroom door de ETC onderdrukt en verbruikt complex IV zuurstof op het maximale niveau. Het verschil tussen maximale OCR en basale OCR wordt de reserve ademhalingscapaciteit genoemd, wat een maat is voor het vermogen van de cel om te reageren op een verhoogde energievraag onder stressomstandigheden. Ten slotte wordt een mengsel van twee ETC-remmers (rotenon, een complex I-remmer en antimycine A, een complexeIII-remmer 17) geïnjecteerd, waardoor de elektronenstroom volledig wordt afgesloten en OCR tot een laag niveau afneemt. OCR gemeten na rotenon en antimycine A-injectie komt overeen met niet-mitochondriale OCR aangedreven door andere processen in de cellen. Niet-mitochondriale OCR maakt de berekening van basale ademhaling, protonenlekkage en maximale ademhaling mogelijk.
Basale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen baseline OCR en niet-mitochondriale OCR. Protonlek verwijst naar het verschil tussen OCR na oligomycine-injectie en niet-mitochondriale OCR. Maximale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen OCR na FCCP-injectie en niet-mitochondriale OCR. De koppelingsefficiëntie wordt berekend als het percentage atp-productiesnelheid ten opzichte van de basale ademhalingsfrequentie. Dit method paper biedt een gedetailleerd protocol voor het meten van ECAR en OCR in afstammingsnegatieve HSPC’s met behulp van de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyzer. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van muizenlijnnegatieve HSPC’s, verklaart de optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van verschillende geneesmiddelen die worden gebruikt in extracellulaire fluxtests en beschrijft strategieën voor medicamenteuze behandeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit method paper beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor de beoordeling van cellulaire bio-energetica (glycolyse en OxPHOS) in muis HSPC’s met behulp van de Seahorse extracellulaire flux analyzer. Dit apparaat is een krachtig hulpmiddel dat tegelijkertijd de ECAR en OCR van levende cellen meet, die respectievelijk metrieken zijn van glycolyse en mitochondriale ademhaling. Het kan dus worden gebruikt om de cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen. Verder biedt het 96-well microplate-gebaseerde platform kwa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk in lombard laboratorium wordt ondersteund door de NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 en ME200030) en Glenn Foundation for Medical Research. Het werk in het Li-laboratorium wordt ondersteund door NIH (NHLBI 5R01HL150707).
Materials
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
References
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
- Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
- Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
- Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).
- Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
