Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire
Summary
La méthode présentée ici résume les protocoles optimisés pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives (HSPC) non adhérentes de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des HSPC en temps réel.
Abstract
À l’état d’équilibre, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) restent en grande partie au repos et on pense qu’elles dépendent principalement de la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cependant, dans des conditions de stress telles qu’une infection ou une perte de sang, les CSH deviennent prolifératifs et produisent rapidement des cellules progénitrices en aval, qui à leur tour se différencient davantage, produisant finalement des cellules sanguines matures. Au cours de ce processus de transition et de différenciation, les CSH sortent de la quiescence et subissent rapidement un passage métabolique de la glycolyse à la phosphorylation oxydative (OxPHOS). Diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité, peuvent avoir un impact négatif sur la fonction mitochondriale et peuvent donc modifier la reprogrammation métabolique et la différenciation des CSH et des progéniteurs pendant l’hématopoïèse. Des informations précieuses sur les fonctions glycolytiques et mitochondriales des CSH et des progéniteurs dans des conditions normales et de stress peuvent être obtenues grâce à l’évaluation de leur taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et de leur taux de consommation d’oxygène (OCR), qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement.
Ici, un protocole détaillé est fourni pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les populations de cellules de lignée négative dérivées de la moelle osseuse de souris, qui comprennent à la fois des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices primitives (HSPC), à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Ce protocole décrit des approches pour isoler les cellules de lignée négative de la moelle osseuse de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de 2-désoxy-D-glucose (2-DG, un analogue du glucose qui inhibe la glycolyse) et de divers médicaments ciblant OxPHOS (oligomycine, FCCP, roténone et antimycine A) utilisés dans ces tests, et décrit les stratégies de traitement médicamenteux. Les paramètres clés du flux glycolytique, tels que la glycolyse, la capacité glycolytique et la réserve glycolytique, et les paramètres OxPHOS, tels que la respiration basale, la respiration maximale, la fuite de protons, la production d’ATP, la capacité respiratoire de rechange et l’efficacité du couplage, peuvent être mesurés dans ces essais. Ce protocole permet des mesures ECAR et OCR sur des HSPC non adhérents et peut être généralisé pour optimiser les conditions d’analyse pour tout type de cellules de suspension.
Introduction
L’hématopoïèse est le processus par lequel divers types de cellules sanguines matures ayant des fonctions hautement spécialisées sont formés à partir deCSH 1. Les CSH sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier en diverses populations progénitrices multipotentes et spécifiques à la lignée. Ces progéniteurs produisent finalement des cellules de lignées lymphoïdes, myéloïdes, érythroïdes et mégacarytaires. Pour maintenir leur capacité d’auto-renouvellement, les CSH restent en grande partie au repos et, comme d’autres cellules souches tissulaires, on pense qu’elles reposent sur la glycolyse plutôt que sur l’OxPHOS mitochondrial pour la production d’ATP 2,3. L’entrée dans le cycle cellulaire entraîne une amélioration de la respiration et de l’OxPHOS, ce qui entraîne des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui nuisent au maintien et à la fonctionHSC 3. Une division cellulaire répétée peut donc conduire à une réduction de la capacité d’auto-renouvellement des CSH et, finalement, à leur épuisement.
Dans l’hématopoïèse adulte, les CSH subissent principalement une division cellulaire asymétrique, au cours de laquelle l’une des cellules filles conserve le potentiel HSC et continue de dépendre du métabolisme glycolytique. L’autre cellule fille devient une cellule progénitrice primitive qui perd sa capacité d’auto-renouvellement mais prolifère et finit par donner naissance à des cellules hématopoïétiques fonctionnelles différenciées4. Lorsque les CSH se différencient pour produire des progéniteurs en aval, on pense qu’un passage de la glycolyse au métabolisme mitochondrial se produit pour fournir l’énergie et les blocs de construction nécessaires pour soutenir cette transition rapide5, comme le suggèrent les observations selon lesquelles les CSH possèdent une masse mitochondriale inactive 6,7,8,9 . En revanche, l’activité mitochondriale (indiquée par les niveaux de ROS liés) est beaucoup plus élevée chez les progéniteurs engagés dans la lignée que dans les CSH 9,10,11. Les changements métaboliques qui se produisent au cours de la première étape de l’hématopoïèse suggèrent donc un rôle direct et crucial des mitochondries dans la régulation du devenir du HSC.
Les mitochondries dysfonctionnelles présentes dans diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité12, peuvent interférer avec la capacité d’auto-renouvellement des CSH, induisant un déséquilibre dans la différenciation des CSH / progéniteurs en produisant des quantités excessives de ROS, en altérant la production d’ATP et / ou en modifiant d’autres processus métaboliques 9,12,13 . Les perturbations de l’homéostasie métabolique dans la différenciation HSC/progéniteur pourraient avoir un impact significatif sur l’hématopoïèse, contribuant potentiellement au développement d’anomalies hématologiques13. Compte tenu des influences critiques de la glycolyse et de l’OxPHOS mitochondrial sur la tige et la différenciation des CSH, il est intéressant d’étudier à la fois les paramètres métaboliques dans des conditions normales et de stress. Des informations précieuses sur la fonction glycolytique et mitochondriale des CSH et des cellules progénitrices peuvent être obtenues en évaluant leur ECAR et leur OCR, qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement.
L’analyseur de flux extracellulaire Seahorse est un appareil puissant équipé de deux sondes par puits pour mesurer simultanément l’ECAR et l’OCR dans les cellules vivantes et peut donc être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel, en réponse à divers substrats ou inhibiteurs. La cartouche de dosage utilisée avec l’analyseur contient des orifices d’injection pour contenir jusqu’à quatre médicaments pour injection automatisée pendant le test. Un schéma d’un test de stress typique de glycolyse est illustré à la figure 1A. Le test commence par la mesure de l’ECAR des cellules, incubées dans un milieu de test de stress de glycolyse contenant de la glutamine mais pas du glucose ou du pyruvate. Cela représente l’acidification due aux activités non glycolytiques des cellules et est rapporté comme une acidification non glycolytique. Ceci est suivi par l’injection de glucose à une concentration saturante. Par glycolyse, le glucose dans la cellule est converti en pyruvate, qui est ensuite métabolisé dans le cytoplasme pour produire du lactate, ou dans les mitochondries pour produire du CO2 et de l’eau.
La conversion du glucose en lactate provoque une production nette et une libération ultérieure de protons dans le milieu extracellulaire, ce qui entraîne une augmentation rapide de l’ECAR 14,15,16. Ce changement stimulé par le glucose dans l’ECAR est rapporté comme glycolyse dans des conditions basales. La deuxième injection consiste en oligomycine (un inhibiteur de l’ATP synthase, alias complexe V17), qui inhibe la production mitochondriale d’ATP. Au cours de l’inhibition de l’OxPHOS médiée par l’oligomycine, les cellules régulent au maximum la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cela provoque une augmentation supplémentaire de l’ECAR, révélant la capacité glycolytique maximale des cellules. La différence entre la capacité glycolytique maximale et la glycolyse basale est appelée réserve glycolytique. Enfin, le 2-DG est injecté, ce qui provoque une baisse significative de l’ECAR, généralement proche des niveaux d’acidification non glycolytique. Le 2-DG est un analogue du glucose qui se lie de manière compétitive à l’hexokinase, ce qui entraîne une inhibition de la glycolyse18. Ainsi, la diminution de l’ECAR induite par le 2-DG confirme en outre que la glycolyse est bien la source d’ECAR observée après des injections de glucose et d’oligomycine.
La figure 1B montre le schéma d’un test de stress mitochondrial typique. Le test commence par la mesure OCR de base des cellules, incubées dans un milieu de test de stress mitochondrial contenant du glucose, de la glutamine et du pyruvate. Après des mesures OCR basales, l’oligomycine est injectée dans ce test, qui inhibe le complexe V, réduisant ainsi le flux d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons (ETC)17. Par conséquent, l’OCR est réduite en réponse à l’injection d’oligomycine, et cette diminution de l’OCR est liée à la production mitochondriale d’ATP. La deuxième injection consiste en cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), un protonophore et un découpleur d’OxPHOS17 mitochondrial. FccP effondre le gradient de protons mitochondriaux en permettant le flux de protons à travers la membrane interne mitochondriale. En raison de l’injection de FCCP, le flux d’électrons à travers l’ETC est déprimé et le complexe IV consomme de l’oxygène au niveau maximal. La différence entre l’OCR maximal et l’OCR basale est appelée capacité respiratoire de rechange, qui est une mesure de la capacité de la cellule à répondre à une demande d’énergie accrue dans des conditions de stress. Enfin, un mélange de deux inhibiteurs de l’ETC (roténone, un inhibiteur du complexe I, et antimycine A, un inhibiteur du complexe III17) est injecté, ce qui arrête complètement le flux d’électrons et l’OCR diminue à un faible niveau. L’OCR mesurée après injection de roténone et d’antimycine A correspond à l’OCR non mitochondriale entraînée par d’autres processus à l’intérieur des cellules. L’OCR non mitochondriale permet de calculer la respiration basale, la fuite de protons et la respiration maximale.
La respiration basale représente la différence entre l’OCR de base et l’OCR non mitochondriale. La fuite de protons fait référence à la différence entre l’OCR après injection d’oligomycine et l’OCR non mitochondriale. La respiration maximale représente la différence entre l’OCR après injection de FCCP et l’OCR non mitochondriale. L’efficacité du couplage est calculée comme le pourcentage du taux de production d’ATP au taux de respiration basale. Ce document de méthode fournit un protocole détaillé pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les HSPC à l’ordre négatif à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe96. Ce protocole décrit les approches pour isoler les HSPC négatifs à la lignée de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de divers médicaments utilisés dans les tests de flux extracellulaire et décrit les stratégies de traitement médicamenteux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article de méthode décrit un protocole optimisé pour l’évaluation de la bioénergétique cellulaire (glycolyse et OxPHOS) dans les HSPC de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse. Cet appareil est un outil puissant qui mesure simultanément l’ECAR et l’OCR des cellules vivantes, qui sont des mesures de la glycolyse et de la respiration mitochondriale, respectivement. Ainsi, il peut être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel. De plus, la plate-form…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux en laboratoire Lombard sont soutenus par les NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), doD (CA190267, CA170628, NF170044 et ME200030) et la Glenn Foundation for Medical Research. Le travail en laboratoire Li est soutenu par les NIH (NHLBI 5R01HL150707).
Materials
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
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