Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare
Summary
Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l’analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.
Abstract
Allo stato stazionario, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) rimangono in gran parte quiescenti e si ritiene che dipendano prevalentemente dalla glicolisi per soddisfare le loro esigenze energetiche. Tuttavia, in condizioni di stress come infezioni o perdita di sangue, le HSC diventano proliferative e producono rapidamente cellule progenitrici a valle, che a loro volta si differenziano ulteriormente, producendo infine cellule del sangue mature. Durante questo processo di transizione e differenziazione, le HSC escono dalla quiescenza e subiscono rapidamente un passaggio metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa (OxPHOS). Varie condizioni di stress, come l’invecchiamento, il cancro, il diabete e l’obesità, possono avere un impatto negativo sulla funzione mitocondriale e quindi possono alterare la riprogrammazione metabolica e la differenziazione delle HSC e dei progenitori durante l’ematopoiesi. Preziose informazioni sulle funzioni glicolitiche e mitocondriali di HSC e progenitori in condizioni normali e di stress possono essere ottenute attraverso la valutazione del loro tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e del tasso di consumo di ossigeno (OCR), che sono indicatori di glicolisi cellulare e respirazione mitocondriale, rispettivamente.
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per misurare ECAR e OCR in popolazioni di cellule derivate dal midollo osseo di topo, che includono sia cellule staminali ematopoietiche che cellule progenitrici primitive (HSPC), utilizzando l’analizzatore di flusso extracellulare. Questo protocollo descrive gli approcci per isolare le cellule negative al lignaggio dal midollo osseo del topo, spiega l’ottimizzazione della densità di semina cellulare e le concentrazioni di 2-deossi-D-glucosio (2-DG, un analogo del glucosio che inibisce la glicolisi) e vari farmaci mirati a OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A) utilizzati in questi saggi e descrive le strategie di trattamento farmacologico. In questi saggi possono essere misurati i parametri chiave del flusso glicolitico, come la glicolisi, la capacità glicolitica e la riserva glicolitica e i parametri OxPHOS, come la respirazione basale, la respirazione massima, la perdita di protoni, la produzione di ATP, la capacità respiratoria di riserva e l’efficienza di accoppiamento. Questo protocollo consente misurazioni ECAR e OCR su HSPC non aderenti e può essere generalizzato per ottimizzare le condizioni di analisi per qualsiasi tipo di cella di sospensione.
Introduction
L’ematopoiesi è il processo mediante il quale vari tipi di cellule del sangue mature con funzioni altamente specializzate sono formate da HSC1. Le HSC sono in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi in varie popolazioni progenitrici multipotenti e specifiche del lignaggio. Questi progenitori alla fine producono cellule di lignaggi linfoidi, mieloidi, eritroidi e megacariociti. Per mantenere la loro capacità di auto-rinnovamento, le HSC rimangono in gran parte quiescenti e, come altre cellule staminali tissutali, si ritiene che si basino sulla glicolisi piuttosto che sull’OxPHOS mitocondriale per la produzione di ATP 2,3. L’ingresso nel ciclo cellulare porta a una migliore respirazione e OxPHOS, con conseguenti livelli elevati di specie reattive dell’ossigeno (ROS), che sono dannosi per il mantenimento e la funzione HSC3. La divisione cellulare ripetuta può quindi portare a una ridotta capacità di auto-rinnovamento delle HSC e, in definitiva, al loro esaurimento.
Nell’emopoiesi adulta, le HSC subiscono principalmente una divisione cellulare asimmetrica, durante la quale una delle cellule figlie mantiene il potenziale HSC e continua a fare affidamento sul metabolismo glicolitico. L’altra cellula figlia diventa una cellula progenitrice primitiva che perde la capacità di auto-rinnovamento ma prolifera e alla fine dà origine a cellule ematopoietiche funzionali differenziate4. Quando le HSC si differenziano per produrre progenitori a valle, si pensa che si verifichi un passaggio dalla glicolisi al metabolismo mitocondriale per fornire l’energia e gli elementi costitutivi necessari per supportare questa rapida transizione5, come suggerito dalle osservazioni che le HSC possiedono massa mitocondriale inattiva 6,7,8,9 . Al contrario, l’attività mitocondriale (indicata dai livelli di ROS collegati) è molto più alta nei progenitori impegnati nel lignaggio rispetto alle HSC 9,10,11. I cambiamenti metabolici che si verificano durante la prima fase dell’ematopoiesi suggeriscono quindi un ruolo diretto e cruciale dei mitocondri nella regolazione del destino HSC.
I mitocondri disfunzionali presenti in varie condizioni di stress, come l’invecchiamento, il cancro, il diabete e l’obesità12, possono interferire con la capacità di auto-rinnovamento HSC, inducendo uno squilibrio nella differenziazione HSC / progenitore producendo quantità eccessive di ROS, compromettendo la produzione di ATP e / o alterando altri processi metabolici 9,12,13 . Le perturbazioni nell’omeostasi metabolica nel differenziamento HSC/progenitore potrebbero avere un impatto significativo sull’ematopoiesi, contribuendo potenzialmente allo sviluppo di anomalie ematologiche13. Date le influenze critiche della glicolisi e dell’OxPHOS mitocondriale sulla staminalità e la differenziazione dell’HSC, è interessante studiare sia i parametri metabolici in condizioni normali che di stress. Preziose informazioni sulla funzione glicolitica e mitocondriale delle HSC e delle cellule progenitrici possono essere ottenute valutando la loro ECAR e OCR, che sono indicatori di glicolisi cellulare e respirazione mitocondriale, rispettivamente.
L’analizzatore di flusso extracellulare Seahorse è un potente apparato dotato di due sonde per pozzo per misurare contemporaneamente ECAR e OCR in cellule vive e quindi può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale, in risposta a vari substrati o inibitori. La cartuccia di analisi utilizzata con l’analizzatore contiene porte di iniezione per contenere fino a quattro farmaci per l’iniezione automatica durante il test. Uno schema di un tipico test di stress della glicolisi è mostrato nella Figura 1A. Il test inizia con la misurazione dell’ECAR delle cellule, incubate in mezzo di prova da stress di glicolisi contenente glutammina ma non glucosio o piruvato. Ciò rappresenta l’acidificazione che si verifica a causa delle attività non glicolitiche delle cellule ed è riportata come acidificazione non glicolitica. Questo è seguito dall’iniezione di glucosio a una concentrazione saturante. Attraverso la glicolisi, il glucosio nella cellula viene convertito in piruvato, che viene ulteriormente metabolizzato nel citoplasma per produrre lattato, o nei mitocondri per produrre CO2 e acqua.
La conversione del glucosio in lattato provoca la produzione netta e il successivo rilascio di protoni nel mezzo extracellulare, con conseguente rapido aumento dell’ECAR 14,15,16. Questo cambiamento stimolato dal glucosio in ECAR è riportato come glicolisi in condizioni basali. La seconda iniezione consiste in oligomicina (un inibitore dell’ATP sintasi, noto anche come complesso V17), che inibisce la produzione mitocondriale di ATP. Durante l’inibizione dell’OxPHOS mediata dall’oligomicina, le cellule sovraregolano al massimo la glicolisi per soddisfare le loro esigenze energetiche. Ciò provoca un ulteriore aumento dell’ECAR, rivelando la massima capacità glicolitica delle cellule. La differenza tra la capacità glicolitica massima e la glicolisi basale è indicata come riserva glicolitica. Infine, viene iniettato 2-DG, che provoca un calo significativo dell’ECAR, di solito vicino ai livelli di acidificazione non glicolitica. 2-DG è un analogo del glucosio che si lega in modo competitivo all’esochinasi, con conseguente inibizione della glicolisi18. Pertanto, la diminuzione indotta da 2-DG nell’ECAR conferma ulteriormente che la glicolisi è effettivamente la fonte di ECAR osservata dopo iniezioni di glucosio e oligomicina.
La Figura 1B mostra lo schema per un tipico test di stress mitocondriale. Il test inizia con la misurazione OCR al basale delle cellule, incubate in mezzo di prova da stress mitocondriale contenente glucosio, glutammina e piruvato. A seguito di misurazioni OCR basali, l’oligomicina viene iniettata in questo test, che inibisce il complesso V, riducendo così il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC)17. Di conseguenza, l’OCR è ridotto in risposta all’iniezione di oligomicina e questa diminuzione dell’OCR è legata alla produzione mitocondriale di ATP. La seconda iniezione consiste in carbonile cianuro-4 (trifluorometossico) fenilidrazone (FCCP), un protonoforo e un disaccoppiatore di OxPHOS17 mitocondriale. FCCP collassa il gradiente protonico mitocondriale consentendo il flusso di protoni attraverso la membrana interna mitocondriale. A causa dell’iniezione FCCP, il flusso di elettroni attraverso l’ETC viene depresso e il complesso IV consuma ossigeno al massimo livello. La differenza tra OCR massimo e OCR basale è indicata come capacità respiratoria di riserva, che è una misura della capacità della cellula di rispondere all’aumento della domanda di energia in condizioni di stress. Infine, viene iniettata una miscela di due inibitori ETC (rotenone, un inibitore del complesso I e antimicina A, un inibitore del complesso III17), che arresta completamente il flusso di elettroni e l’OCR diminuisce a un livello basso. L’OCR misurato dopo l’iniezione di rotenone e antimicina A corrisponde all’OCR non mitocondriale guidato da altri processi all’interno delle cellule. L’OCR non mitocondriale consente il calcolo della respirazione basale, della perdita di protoni e della respirazione massima.
La respirazione basale rappresenta la differenza tra OCR basale e OCR non mitocondriale. La perdita di protoni si riferisce alla differenza tra oCR dopo iniezione di oligomicina e OCR non mitocondriale. La respirazione massima rappresenta la differenza tra oCR dopo iniezione di FCCP e OCR non mitocondriale. L’efficienza di accoppiamento è calcolata come percentuale del tasso di produzione di ATP rispetto alla frequenza di respirazione basale. Questo documento di metodo fornisce un protocollo dettagliato per misurare ECAR e OCR in HSPC negativi alla linea utilizzando l’analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XFe96. Questo protocollo descrive gli approcci per isolare gli HSPC negativi al lignaggio del topo, spiega l’ottimizzazione della densità di semina cellulare e delle concentrazioni di vari farmaci utilizzati nei saggi di flusso extracellulare e descrive le strategie di trattamento farmacologico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento di metodo descrive un protocollo ottimizzato per la valutazione della bioenergetica cellulare (glicolisi e OxPHOS) negli HSPC di topo utilizzando l’analizzatore di flusso extracellulare Seahorse. Questo dispositivo è un potente strumento che misura contemporaneamente l’ECAR e l’OCR delle cellule vive, che sono metriche della glicolisi e della respirazione mitocondriale, rispettivamente. Pertanto, può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale. Inoltre, la piattaforma basat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro nel laboratorio lombardo è supportato dal NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 e ME200030) e Glenn Foundation for Medical Research. Il lavoro nel laboratorio Li è supportato da NIH (NHLBI 5R01HL150707).
Materials
| 0.2 μm filter | Corning | 430626 | Used to filter-sterilize the assay media |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test assay medium |
| 15 mL conical Falcon tubes | Corning | 352096 | Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 3rd drug injection during glycolysis stress test |
| 5x Enrichment buffer (MojoSort) | Biolegend | 480017 | Used for washings during HSPCs harvest |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | Component of ACK lysis buffer |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Bio-Rad DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | Used as per manufacturer's instructions |
| Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | 2nd drug injection during mitochondrial stress test |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Used for coating cell microplates |
| Countes 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | For cell counting | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer |
| Falcon 70 μm filter | Fisher Scientific | 08-771-2 | Used as cells strainer during HSPCs harvest |
| Gibco Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | 2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | Used to wash cells after assay for protein quantification |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | Component of ACK lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC. |
| Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | 3rd drug injection during mitochondrial stress test |
| Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer | Seahorse Biosciences now Agilent | For ECAR and OCR measurments in real time. | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma-Aldrich | S7920 | Component of RIPA lysis buffer |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | Prepared 1 N solution. Used for pH normalization |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | Used for lineage depletion during HSPCs harvest |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | Component of RIPA lysis buffer |
| XF base medium | Agilent | 102353-100 | base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media |
| XF prep station | Seahorse Biosciences | Used for non-CO2 37 °C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 or 102601-100 | Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate |
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