التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران
Summary
اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. تعد الأنسجة وفحص انهيار الحاجز الدموي والشبكية وتصوير الأوعية الفلورية تقنيات قيمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية ، والتي يمكن أن تعزز الفحص الفعال للأدوية ضد اعتلال الشبكية السكري.
Abstract
يغير مرض العين في الجزء الخلفي مثل اعتلال الشبكية السكري فسيولوجيا الشبكية. يتميز اعتلال الشبكية السكري بانفصال الشبكية ، وانهيار حاجز الشبكية الدموي (BRB) ، وتكوين الأوعية الدموية في الشبكية. نموذج الفئران في الجسم الحي هو أداة تجريبية قيمة لدراسة التغيرات في بنية ووظيفة شبكية العين. نقترح ثلاث تقنيات تجريبية مختلفة في نموذج الفئران لتحديد التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية ، والأوعية الدموية الشبكية ، و BRB المعرضة للخطر. يستخدم علم أنسجة الشبكية لدراسة مورفولوجيا خلايا الشبكية المختلفة. أيضا ، يتم إجراء القياس الكمي عن طريق عدد خلايا الشبكية وقياس سمك طبقات الشبكية المختلفة. يستخدم اختبار انهيار BRB لتحديد تسرب البروتينات خارج العين من البلازما إلى الأنسجة الزجاجية بسبب انهيار BRB. يستخدم تصوير الأوعية الدموية الفلوري لدراسة تولد الأوعية الدموية وتسرب الأوعية الدموية عن طريق تصور الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام صبغة FITC-dextran.
Introduction
اعتلال الشبكية السكري (DR) هو واحد من أكثر المضاعفات الثانوية تعقيدا لمرض السكري. كما أنه السبب الرئيسي للعمى الذي يمكن الوقاية منه بين السكان في سن العمل في جميع أنحاء العالم. في تحليل تلوي حديث ل 32.4 مليون شخص كفيف ، كان 830،000 شخص (2.6٪) مكفوفين بسبب DR1. احتلت نسبة فقدان البصر المنسوبة إلى مرض السكري المرتبة السابعة في عام 2015 بنسبة 1.06٪ (0.15-2.38) على مستوى العالم2,3.
يتم تشخيص اعتلال الشبكية السكري عن طريق تشوهات الأوعية الدموية في أنسجة العين الخلفية. سريريا ، ينقسم إلى مرحلتين – DR غير التكاثري (NPDR) و DR التكاثري (PDR) ، بناء على الأوعية الدموية في شبكية العين. يعتبر ارتفاع السكر في الدم المنظم القوي ل DR لأنه ينطوي على العديد من المسارات المشاركة في التنكس العصبي4,5 والالتهاب 6,7 والأوعية الدموية الدقيقة8 في شبكية العين. تشمل المضاعفات الأيضية المتعددة الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم تراكم المنتجات النهائية المتقدمة للغليكاتيون (AGEs) ، ومسار البوليول ، ومسار الهيكسوسامين ، ومسار بروتين كيناز-سي. هذه المسارات مسؤولة عن تكاثر الخلايا (الخلايا البطانية) ، والهجرة (pericytes) ، وموت الخلايا المبرمج (خلايا الشبكية العصبية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا البطانية) بناء على مراحل مختلفة من اعتلال الشبكية السكري. يمكن أن تؤدي هذه التغيرات الأيضية إلى تغيرات فسيولوجية مثل انفصال الشبكية ، وفقدان خلايا الشبكية ، وانهيار حاجز الدم والشبكية (BRB) ، وتمدد الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية الدموية9.
مرض السكري من النوع 1 الناجم عن الستربتوزوتوسين (STZ) هو ممارسة راسخة ومقبولة جيدا في الفئران لتقييم التسبب في مرض السكري ومضاعفاته. ترجع الآثار السكرية ل STZ إلى التدمير الانتقائي لخلايا جزيرة البنكرياس β 10. ونتيجة لذلك ، ستخضع الحيوانات لنقص الأنسولين ، وارتفاع السكر في الدم ، و polydipsia ، و polyuria ، وكلها خصائص لمرض السكري من النوع 1 البشري11. بالنسبة لتحريض مرض السكري الحاد ، يتم إعطاء STZ عند 40-65 مجم / كجم من وزن الجسم عن طريق الوريد أو داخل الصفاق خلال مرحلة البلوغ. بعد حوالي 72 ساعة ، تقدم هذه الحيوانات مستويات الجلوكوز في الدم أكبر من 250 ملغ / ديسيلتر 10,12.
لفهم التغيرات الفسيولوجية في شبكية العين بسبب التنكس العصبي والالتهابات وتكوين الأوعية الدموية ، يجب تحسين التقنيات المختلفة في النماذج الحيوانية التجريبية. يمكن دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في خلايا الشبكية وأوعية الشبكية من خلال تقنيات مختلفة مثل علم الأنسجة وفحص انهيار BRB وتصوير الأوعية الفلورية.
يتضمن علم الأنسجة دراسة تشريح الخلايا والأنسجة والأعضاء على المستوى المجهري. وهو ينشئ علاقة بين بنية ووظيفة الخلايا / الأنسجة. يتم تنفيذ عدة خطوات لتصور وتحديد التغيرات المجهرية في بنية الأنسجة ، وبالتالي مقارنة النظراء الأصحاء والمريضين 13. وبالتالي ، من الضروري توحيد كل خطوة من خطوات علم الأنسجة بدقة. الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها علم أنسجة الشبكية هي تثبيت العينة ، وتقليم العينة ، والجفاف ، وإزالة ، والتشريب بالبارافين ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتلطيخ (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين) 13،14.
في شبكية العين السليمة ، يتم التحكم في نقل الجزيئات عبر شبكية العين بواسطة BRB ، الذي يتكون من الخلايا البطانية والخلايا المحيطة على الجانب الداخلي ، والخلايا الظهارية الصباغية الشبكية على الجانب الخارجي. ومع ذلك ، تبدأ الخلايا البطانية BRB الداخلية والخلايا المحيطة في التدهور أثناء الحالة المريضة ، كما أن BRB معرض للخطر أيضا15. بسبب هذا الانهيار BRB ، تتسرب العديد من جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية 16. مع تقدم المرض ، تتسرب العديد من جزيئات البروتين الأخرى (الوزن الجزيئي المنخفض والمرتفع) أيضا إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية بسبب اضطراب التوازن 17. يؤدي إلى مضاعفات أخرى مختلفة وفي نهاية المطاف وذمة بقعية وعمى. وبالتالي ، فإن تحديد مستويات البروتين في الجسم الزجاجي ومقارنة الحالات الصحية والسكري يضر بمقاييس BRB.
تصوير الأوعية الفلورية هو تقنية تستخدم لدراسة الدورة الدموية للشبكية والمشيمية باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم استخدامه لتصور الأوعية الدموية في شبكية العين والمشيمية عن طريق حقن صبغة الفلوريسين عبر الوريد أو حقن القلب18. بمجرد حقن الصبغة ، تصل أولا إلى شرايين الشبكية ، تليها أوردة الشبكية. عادة ما يتم الانتهاء من هذا الدوران للصبغة في غضون 5 إلى 10 دقائق من حقن الصبغة19. إنها تقنية مهمة لتشخيص مختلف أمراض العين في الجزء الخلفي، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري والأوعية الدموية الجديدة المشيمية20. يساعد على اكتشاف التغيرات الرئيسية والثانوية في الأوعية الدموية في الحالات الطبيعية والمريضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
علم الأنسجة
يتم إجراء علم الأنسجة الشبكية لتصور التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية وطبقاتها. يجب تحسين العديد من الخطوات ، بما في ذلك اختيار الحل المثبت ، ومدة التثبيت ، والجفاف ، وتشريب البارافين. يجب ألا يتجاوز حجم الأنسجة 3 مم ، حيث يصبح الاختراق المثبت بطيئا. يؤدي البارفو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن ينوه بالمجلس الهندي للبحوث الطبية (ICMR; ITR-2020-2882) لتمويل الدعم المقدم إلى الدكتور نيرمال ج. نود أيضا أن نشكر منحة الجامعة للجنة على توفير زمالة بحثية مبتدئة لمانيشا مالاني ومرفق المختبرات التحليلية المركزي ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد لتوفير مرافق البنية التحتية.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
