Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell
Summary
Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.
Abstract
Eine Augenerkrankung des hinteren Segments wie die diabetische Retinopathie verändert die Physiologie der Netzhaut. Die diabetische Retinopathie ist gekennzeichnet durch eine Netzhautablösung, den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) und die retinale Angiogenese. Ein In-vivo-Rattenmodell ist ein wertvolles experimentelles Werkzeug, um die Veränderungen in der Struktur und Funktion der Netzhaut zu untersuchen. Wir schlagen drei verschiedene experimentelle Techniken im Rattenmodell vor, um morphologische Veränderungen von Netzhautzellen, retinalen Gefäßen und kompromittiertem BRB zu identifizieren. Die Netzhauthistologie wird verwendet, um die Morphologie verschiedener Netzhautzellen zu untersuchen. Die quantitative Messung erfolgt auch durch retinale Zellzählung und Dickenmessung verschiedener Netzhautschichten. Ein BRB-Abbauassay wird verwendet, um das Austreten von extraokularen Proteinen aus dem Plasma in Glaskörper aufgrund des Abbaus von BRB zu bestimmen. Die Fluoreszenzangiographie wird verwendet, um die Angiogenese und das Austreten von Blutgefäßen zu untersuchen, indem retinale Gefäße mit FITC-Dextran-Farbstoff sichtbar gemacht werden.
Introduction
Die diabetische Retinopathie (DR) ist eine der komplexesten sekundären Komplikationen des Diabetes mellitus. Es ist auch die Hauptursache für vermeidbare Blindheit in der Bevölkerung im erwerbsfähigen Alter weltweit. In einer kürzlich durchgeführten Meta-Analyse von 32,4 Millionen blinden Menschen waren 830.000 (2,6%) Menschen aufgrund von DR1 blind. Der Anteil des Sehverlusts, der auf Diabetes zurückzuführen ist, belegte 2015 mit 1,06% (0,15-2,38) weltweit den siebten Platz2,3.
Die diabetische Retinopathie wird durch Gefäßanomalien im hinteren Augengewebe diagnostiziert. Klinisch ist es in zwei Stadien unterteilt – Non-Proliferative DR (NPDR) und Proliferative DR (PDR), basierend auf der Vaskularisation in der Netzhaut. Hyperglykämie gilt als der potente Regulator von DR, da sie mehrere Wege impliziert, die an Neurodegeneration4,5, Entzündungen6,7 und Mikrovaskulaturen8 in der Netzhaut beteiligt sind. Zu den multiplen metabolischen Komplikationen, die aufgrund von Hyperglykämie induziert werden, gehören die Anhäufung von fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs), Polyolweg, Hexosaminweg und Proteinkinase-C-Signalweg. Diese Signalwege sind verantwortlich für die Zellproliferation (Endothelzellen), Migration (Perizyten) und Apoptose (neuronale Netzhautzellen, Perizyten und Endothelzellen), die auf verschiedenen Stadien der diabetischen Retinopathie basieren. Diese metabolischen Veränderungen können zu physiologischen Veränderungen wie Netzhautablösung, Verlust von Netzhautzellen, Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB), Aneurysmen und Angiogenese führen9.
Streptozotocin (STZ) -induzierter Typ-1-Diabetes ist eine etablierte und akzeptierte Praxis bei Ratten zur Bewertung der Diabetes-Pathogenese und ihrer Komplikationen. Diabetogene Wirkungen von STZ sind auf die selektive Zerstörung der Pankreasinsel β-Zellen zurückzuführen10. Infolgedessen erleiden die Tiere Insulinmangel, Hyperglykämie, Polydipsie und Polyurie, die alle für den menschlichen Typ-1-Diabetes mellitus charakteristisch sind11. Bei schwerer Diabetes-Induktion wird STZ bei 40-65 mg/kg Körpergewicht intravenös oder intraperitoneal im Erwachsenenalter verabreicht. Nach etwa 72 h weisen diese Tiere einen Blutzuckerspiegel von mehr als 250 mg/dL10,12 auf.
Um die physiologischen Veränderungen der Netzhaut durch Neurodegeneration, Entzündung und Angiogenese zu verstehen, sollten verschiedene Techniken in experimentellen Tiermodellen optimiert werden. Strukturelle und funktionelle Veränderungen in Netzhautzellen und Netzhautgefäßen können durch verschiedene Techniken wie Histologie, BRB-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie untersucht werden.
Histologie beinhaltet das Studium der Anatomie von Zellen, Geweben und Organen auf mikroskopischer Ebene. Es stellt eine Korrelation zwischen der Struktur und Funktion von Zellen/Gewebe her. Es werden mehrere Schritte durchgeführt, um die mikroskopischen Veränderungen in der Gewebestruktur zu visualisieren und zu identifizieren und dabei gesunde und kranke Gegenstücke zu vergleichen13. Daher ist es wichtig, jeden Schritt der Histologie sorgfältig zu standardisieren. Verschiedene Schritte in der Netzhauthistologie sind die Fixierung der Probe, das Trimmen der Probe, Dehydratisierung, Clearing, Imprägnierung mit Paraffin, Paraffineinbettung, Schnitt und Färbung (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung)13,14.
In einer gesunden Netzhaut wird der Transport von Molekülen über die Netzhaut durch BRB gesteuert, das aus Endothelzellen und Perizyten auf der Innenseite und retinalen Pigmentepithelzellen auf der Außenseite besteht. Innere BRB-Endothelzellen und Perizyten beginnen jedoch während des erkrankten Zustands zu degenerieren, und BRB ist ebenfalls kompromittiert15. Aufgrund dieses BRB-Abbaus gelangen viele niedermolekulare Moleküle in Glaskörper und Netzhautgewebe16. Wenn die Krankheit fortschreitet, treten aufgrund von Homöostasestörungen auch viele andere Proteinmoleküle (niedriges und hohes Molekulargewicht) in Glaskörper und Netzhautgewebe aus17. Es führt zu verschiedenen anderen Komplikationen und letztendlich zu Makulaödemen und Blindheit. Daher kompromittierten die Quantifizierung der Proteinspiegel im Glaskörper und der Vergleich von gesunden und diabetischen Zuständen das BRB.
Die Fluoreszenzangiographie ist eine Technik, die verwendet wird, um die Blutzirkulation der Netzhaut und der Aderhaut mit Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen. Es wird verwendet, um das Gefäßsystem der Netzhaut und der Aderhaut zu visualisieren, indem Fluoresceinfarbstoff über intravenösen Weg oder Herzinjektion injiziert wird18. Sobald der Farbstoff injiziert ist, erreicht er zuerst die Netzhautarterien, gefolgt von Netzhautvenen. Diese Zirkulation von Farbstoff wird normalerweise innerhalb von 5 bis 10 Minuten nach der Injektion von Farbstoff19 abgeschlossen. Es ist eine wichtige Technik zur Diagnose verschiedener Augenerkrankungen des hinteren Segments, einschließlich diabetischer Retinopathie und choroidaler Neovaskularisation20. Es hilft, größere und kleine Gefäßveränderungen unter normalen und kranken Zuständen zu erkennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histologie
Die Netzhauthistologie wird durchgeführt, um die morphologischen Veränderungen von Netzhautzellen und -schichten zu visualisieren. Verschiedene Schritte, einschließlich der Wahl der fixativen Lösung, der Fixationsdauer, der Dehydratation und der Paraffinimprägnierung, müssen optimiert werden. Die Gewebegröße sollte 3 mm nicht überschreiten, da die fixative Penetration langsam wird. Das häufig verwendete 4%ige Paraformaldehyd führt aufgrund der relativ hohen Osmolarität der Lösu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) zur Förderung von Dr. Nirmal J. Wir möchten uns auch bei der University Grant of Commission für die Bereitstellung eines Junior Research Fellowship für Manisha Malani und der Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, für die Bereitstellung infrastruktureller Einrichtungen bedanken.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
