ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価
Summary
糖尿病性網膜症は、失明の主な原因の1つです。組織学、血液網膜関門破壊アッセイ、および蛍光血管造影は、網膜の病態生理学を理解するための貴重な技術であり、糖尿病性網膜症に対する効率的な薬物スクリーニングをさらに強化することができる。
Abstract
糖尿病性網膜症のような後部眼疾患は、網膜の生理機能を変化させる。糖尿病性網膜症は、網膜剥離、血液網膜関門(BRB)の破壊、および網膜血管新生を特徴とする。in vivoラットモデルは、網膜の構造と機能の変化を調べるための貴重な実験ツールです。我々は、網膜細胞、網膜血管系、および損なわれたBRBの形態学的変化を同定するために、ラットモデルにおいて3つの異なる実験技術を提案する。網膜組織学は、様々な網膜細胞の形態を研究するために使用される。また、定量的測定は、異なる網膜層の網膜細胞数および厚さ測定によって行われる。BRBブレークダウンアッセイは、BRBの分解による血漿から硝子体組織への眼外タンパク質の漏れを決定するために使用される。蛍光血管造影は、FITCデキストラン色素を用いて網膜血管系を可視化することにより、血管新生および血管の漏出を研究するために使用される。
Introduction
糖尿病性網膜症(DR)は、真性糖尿病の最も複雑な二次合併症の1つです。また、世界中の生産年齢人口における予防可能な失明の主な原因でもあります。3,240万人の盲人を対象とした最近のメタアナリシスでは、83万人(2.6%)がDR1のために失明した。糖尿病に起因する視力喪失の割合は、2015年に1.06%(0.15-2.38)で世界第7位にランクされました2,3。
糖尿病性網膜症は、後眼組織の血管異常によって診断される。臨床的には、網膜における血管新生に基づいて、非増殖性DR(NPDR)および増殖性DR(PDR)の2つの段階に分けられる。高血糖は、網膜の神経変性4,5、炎症6,7、および微小血管系8に関与するいくつかの経路に関与するため、DRの強力な調節因子と考えられています。高血糖のために誘発される複数の代謝合併症には、終末糖化産物(AGE)、ポリオール経路、ヘキソサミン経路、およびプロテインキナーゼ-C経路の蓄積が含まれる。これらの経路は、糖尿病性網膜症の異なる段階に基づく細胞増殖(内皮細胞)、遊走(周皮細胞)、およびアポトーシス(神経網膜細胞、周皮細胞、および内皮細胞)の原因である。これらの代謝変化は、網膜剥離、網膜細胞の喪失、血液網膜関門(BRB)の破壊、動脈瘤、血管新生などの生理学的変化につながる可能性があります9。
ストレプトゾトシン(STZ)誘発性1型糖尿病は、糖尿病の病因およびその合併症を評価するためのラットにおいて十分に確立され、広く受け入れられている慣行である。STZの糖尿病誘発作用は、膵島β細胞の選択的破壊によるものである10。その結果、動物はインスリン欠乏症、高血糖、多飲症、多尿症を受け、これらはすべてヒト1型糖尿病の特徴です11。重度の糖尿病誘発の場合、STZは成人期に静脈内または腹腔内に40〜65mg / kg体重で投与される。約72時間後、これらの動物は250mg / dLを超える血糖値を示す10,12。
神経変性、炎症、および血管新生による網膜の生理学的変化を理解するためには、実験動物モデルにおいて異なる技術を最適化するべきである。網膜細胞および網膜血管の構造的および機能的変化は、組織学、BRBブレークダウンアッセイ、および蛍光血管造影法などの様々な技術によって研究することができる。
組織学は、顕微鏡レベルでの細胞、組織、および器官の解剖学の研究を含む。それは細胞/組織の構造と機能の間の相関関係を確立します。組織構造の微視的な変化を視覚化および同定するためにいくつかのステップが実行され、それによって健康な対応物と罹患した対応物を比較する13。したがって、組織学の各ステップを細心の注意を払って標準化することが不可欠です。網膜組織学に関与する様々なステップは、標本の固定、標本のトリミング、脱水、透明化、パラフィンによる含浸、パラフィン包埋、切片化、および染色(ヘマトキシリンおよびエオジン染色)13,14である。
健康な網膜では、網膜を横切る分子の輸送は、内側の内皮細胞と周皮細胞、外側の網膜色素上皮細胞で構成されるBRBによって制御されます。しかし、内部BRB内皮細胞および周皮細胞は、罹患状態の間に変性を開始し、BRBも損なわれる15。このBRB分解により、多くの低分子量分子が硝子体組織および網膜組織に漏れ出す16。病気が進行するにつれて、他の多くのタンパク質分子(低分子量および高分子量)も恒常性障害のために硝子体および網膜組織に漏れます17。それは様々な他の合併症、そして最終的には黄斑浮腫および失明をもたらす。したがって、硝子体内のタンパク質レベルを定量化し、健常状態と糖尿病状態を比較して、損なわれたBRBを測定する。
蛍光血管造影は、蛍光色素を用いて網膜や脈絡膜の血液循環を研究するために使用される技術である。これは、静脈内経路または心臓注射 を介して フルオレセイン色素を注入することによって、網膜および脈絡膜の血管系を視覚化するために使用される18。色素が注入されると、最初に網膜動脈に到達し、続いて網膜静脈に到達する。この染料の循環は、通常、染料19の注入から5〜10分以内に完了する。糖尿病性網膜症や脈絡膜血管新生を含む様々な後部眼疾患を診断することは重要な技術です20。これは、正常および罹患状態における大小の血管系変化を検出するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織学
網膜組織学は、網膜細胞および層の形態学的変化を視覚化するために行われる。固定液の選択、固定期間、脱水、パラフィン含浸など、さまざまなステップを最適化する必要があります。固定液の浸透が遅くなるため、組織サイズは3mmを超えてはならない。一般的に使用される4%パラホルムアルデヒドは、房水および硝子体液と比較して溶液の浸透圧が比較的高いため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、インド医学研究評議会(ICMR;ITR-2020-2882)は、Nirmal J博士への資金援助のため。また、マニシャ・マラニとハイデラバードキャンパスのBITS-ピラニ中央分析研究所施設にジュニア・リサーチ・フェローシップを提供し、インフラ施設を提供してくれた大学助成金にも感謝します。
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
