Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme
Summary
Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.
Abstract
Diyabetik retinopati gibi bir arka segment göz hastalığı retinanın fizyolojisini değiştirir. Diyabetik retinopati retina dekolmanı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması ve retinal anjiyogenez ile karakterizedir. Bir in vivo sıçan modeli, retinanın yapısındaki ve işlevindeki değişiklikleri incelemek için değerli bir deneysel araçtır. Sıçan modelinde retina hücrelerinin, retina vaskülatürünün ve hasar görmüş BRB’nin morfolojik değişikliklerini tanımlamak için üç farklı deneysel teknik öneriyoruz. Retinal histoloji, çeşitli retina hücrelerinin morfolojisini incelemek için kullanılır. Ayrıca retina hücre sayımı ve farklı retina tabakalarının kalınlık ölçümü ile kantitatif ölçüm yapılır. BRB’nin parçalanması nedeniyle ekstraoküler proteinlerin plazmadan vitreus dokusuna sızmasını belirlemek için BRB parçalanma testi kullanılır. Floresan anjiyografi, FITC-dextran boyası kullanarak retinal vaskülatürü görselleştirerek anjiyogenezi ve kan damarlarının sızıntısını incelemek için kullanılır.
Introduction
Diyabetik retinopati (DR), diabetes mellitusun en karmaşık sekonder komplikasyonlarından biridir. Aynı zamanda dünya çapında çalışma çağındaki nüfusta önlenebilir körlüğün önde gelen nedenidir. 32.4 milyon kör insanın yakın tarihli bir meta-analizinde, 830.000 (% 2.6) kişi DR1 nedeniyle kördü. Diyabete atfedilen görme kaybı oranı, 2015 yılında dünya çapında %1,06 (0,15-2,38) ile yedinci sırada yer almıştır2,3.
Diyabetik retinopati tanısı arka oküler dokulardaki vasküler anormallikler ile konur. Klinik olarak, retinadaki vaskülarizasyona bağlı olarak Proliferatif Olmayan DR (NPDR) ve Proliferatif DR (PDR) olmak üzere iki aşamaya ayrılır. Hiperglisemi, retinada nörodejenerasyon4,5, inflamasyon6,7 ve mikrovaskülatür8 ile ilgili çeşitli yolları içerdiği için DR’nin güçlü düzenleyicisi olarak kabul edilir. Hiperglisemiye bağlı olarak indüklenen çoklu metabolik komplikasyonlar arasında ileri glikasyon son ürünlerinin (AGE’ler), polyol yolunun, hekzozamin yolunun ve protein kinaz-C yolunun birikmesi sayılabilir. Bu yollar, diyabetik retinopatinin farklı evrelerine bağlı olarak hücre proliferasyonu (endotel hücreleri), migrasyon (perisitler) ve apoptozdan (nöral retina hücreleri, perisitler ve endotel hücreleri) sorumludur. Bu metabolik değişiklikler retina dekolmanı, retina hücrelerinin kaybı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması, anevrizmalar ve anjiyogenez gibi fizyolojik değişikliklere yol açabilir9.
Streptozotosin (STZ) ile indüklenen tip-1 diyabet, diyabet patogenezini ve komplikasyonlarını değerlendirmek için sıçanlarda iyi bilinen ve iyi kabul görmüş bir uygulamadır. STZ’nin diyabetojenik etkileri, pankreas adacığının seçici yıkımına bağlıdır β hücreler10. Sonuç olarak, hayvanlar insülin eksikliği, hiperglisemi, polidipsi ve poliüriye maruz kalacaktır ve bunların hepsi insan tipi-1 diabetes mellitusun karakteristiğidir11. Şiddetli diyabet indüksiyonu için STZ, yetişkinlik döneminde intravenöz veya intraperitoneal olarak 40-65 mg / kg vücut ağırlığında uygulanır. Yaklaşık 72 saat sonra, bu hayvanlar 250 mg / dL10,12’den daha yüksek kan şekeri seviyeleri sunar.
Retinanın nörodejenerasyon, inflamasyon ve anjiyogeneze bağlı fizyolojik değişikliklerini anlamak için, deneysel hayvan modellerinde farklı teknikler optimize edilmelidir. Retina hücreleri ve retina damarlarındaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikler histoloji, BRB yıkım testi, floresan anjiyografi gibi çeşitli tekniklerle incelenebilir.
Histoloji, hücrelerin, dokuların ve organların anatomisinin mikroskobik düzeyde incelenmesini içerir. Hücrelerin/dokunun yapısı ve işlevi arasında bir korelasyon kurar. Doku yapısındaki mikroskobik değişiklikleri görselleştirmek ve tanımlamak, böylece sağlıklı ve hastalıklı meslektaşları karşılaştırmak için birkaç adım gerçekleştirilir13. Bu nedenle, histolojinin her adımını titizlikle standartlaştırmak esastır. Retinal histolojide yer alan çeşitli adımlar numunenin fiksasyonu, numunenin kesilmesi, dehidrasyon, temizleme, parafin ile emprenye etme, parafin gömme, kesitleme ve boyama (Hematoksilin ve Eozin boyama)13,14.
Sağlıklı bir retinada, moleküllerin retina boyunca taşınması, iç tarafta endotel hücreleri ve perisitlerden ve dış tarafta retinal pigment epitel hücrelerinden oluşan BRB tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, iç BRB endotel hücreleri ve perisitler hastalıklı durum sırasında dejenere olmaya başlar ve BRB de tehlikeye girer15. Bu BRB parçalanması nedeniyle, birçok düşük molekül ağırlıklı molekül vitreus ve retina dokusuna sızmaktadır16. Hastalık ilerledikçe, diğer birçok protein molekülü (düşük ve yüksek moleküler ağırlık) da homeostaz bozukluğu nedeniyle vitreus ve retina dokusuna sızmaktadır17. Çeşitli diğer komplikasyonlara ve sonuçta makula ödemi ve körlüğe yol açar. Bu nedenle, vitreustaki protein seviyelerinin ölçülmesi ve sağlıklı ve diyabetik durumların karşılaştırılması, BRB’nin tehlikeye atıldığını ölçer.
Floresan anjiyografi, floresan boya kullanarak retina ve koroidin kan dolaşımını incelemek için kullanılan bir tekniktir. İntravenöz yolla veya kardiyak enjeksiyon yoluyla floresein boyası enjekte edilerek retina ve koroid vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılır18. Boya enjekte edildikten sonra, önce retinal arterlere, ardından retinal damarlara ulaşır. Bu boya sirkülasyonu genellikle boya enjeksiyonundan itibaren 5 ila 10 dakika içinde tamamlanır19. Diyabetik retinopati ve koroidal neovaskülarizasyon dahil olmak üzere çeşitli posterior segment oküler hastalıkların tanısında önemli bir tekniktir20. Normal ve hastalıklı durumlarda majör ve minör vaskülatür değişikliklerini tespit etmeye yardımcı olur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histoloji
Retina histolojisi, retina hücrelerinin ve tabakalarının morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için yapılır. Fiksatif çözelti seçimi, fiksasyon süresi, dehidrasyon ve parafin emprenye etme dahil olmak üzere çeşitli adımların optimize edilmesi gerekir. Fiksatif penetrasyon yavaşladığı için doku boyutu 3 mm’yi geçmemelidir. Yaygın olarak kullanılan %4’lük paraformaldehit, çözeltinin sulu mizah ve vitreus mizahına kıyasla nispeten yüksek ozmolaritesi neden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi’ne (ICMR; ITR-2020-2882) Dr. Nirmal J.’ye finansman desteği için Ayrıca, Manisha Malani’ye ve Merkezi Analitik Laboratuvar Tesisi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsüne altyapı tesisi sağladığı için Junior Research Fellowship sağladığı için Üniversite Komisyon Hibesine teşekkür ederiz.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
