通过顺序毛细管辅助组装对微生物和微粒进行图案化
Summary
我们提出了一种技术，该技术在微流体平台中使用毛细管辅助组装，将悬浮在液体中的微尺寸物体（例如细菌和胶体）图案化为聚二甲基硅氧烷衬底上的规定阵列。
Abstract
将微生物控制模式化为定义的空间排列，为广泛的生物学应用提供了独特的可能性，包括微生物生理学和相互作用的研究。在最简单的层面上，微生物的精确空间图案化将实现对大量单个细胞的可靠，长期成像，并改变定量研究距离依赖性微生物 – 微生物相互作用的能力。更独特的是，结合微流体技术提供的精确空间图案和对环境条件的完全控制，将为微生物生态学中的单细胞研究提供一个强大而通用的平台。
本文提出了一个微流体平台，用于在微流体通道内产生多功能和用户定义的微生物模式，从而允许完整的光学访问以进行长期，高通量的监测。这种新的微流体技术基于毛细管辅助颗粒组装，并利用微流体通道内蒸发悬浮液的受控运动产生的毛细管力，将单个微尺寸物体沉积在微细加工到聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物上的一系列陷阱中。顺序沉积生成单个或多个类型的微型物体的所需空间布局，仅由陷阱的几何形状和填充顺序决定。
该平台已使用不同尺寸和材料的胶体颗粒进行校准：它已被证明是生成各种胶体图案并执行捕获颗粒表面功能化的强大工具。此外，该平台在微生物细胞上进行了测试，使用 大肠 杆菌细胞作为模型细菌。成千上万的单个细胞被图案化在表面上，并随着时间的推移监测它们的生长。在这个平台上，单细胞沉积和微流体技术的耦合允许微生物的几何图案化和环境条件的精确控制。因此，它为单个微生物的生理学和微生物 – 微生物相互作用的生态学打开了一扇窗，如初步实验所示。
Introduction
单个微生物的空间模式化，特别是在能够完全控制环境条件的实验领域，如微流体装置，在广泛的背景下是非常可取的。例如，将微生物排列成规则的阵列将允许对大量单个细胞进行精确成像，并研究它们的生长，生理学，响应环境刺激的基因表达和药物敏感性。它还允许研究对细胞通讯（例如，群体感应），交叉喂养（例如，藻类 – 细菌共生）或拮抗（例如，化感作用）特别感兴趣的细胞 – 细胞相互作用，并完全控制细胞相对于彼此的空间定位。细胞生理学和进化研究1，细胞 – 细胞相互作用研究2，表型分化筛选3，环境监测4和药物筛选5 是能够实现这种定量单细胞分析的技术可以极大地受益的领域。
近年来，从全息光学陷阱6和异质表面功能化方法7，8，9，10到单细胞化学抑制剂11和液滴微流体12，已经提出了几种分离和处理单细胞的策略。这些方法要么在技术上要求很高，要么会影响细胞生理学，并且无法提供高通量平台来对可以长期研究的微生物进行模式分析，从而确保单细胞分辨率，完全光学访问和对环境条件的控制。本文的目的是描述一个平台，通过毛细管辅助组装，以微米精度将细菌图案化到PDMS表面上规定的空间排列中。该平台允许对微生物进行精确而灵活的空间图案化，并由于其微流体特性而能够完全光学访问和控制环境条件。
该平台背后的技术是近年来开发的组装技术，名为sCAPA13，14，15（顺序毛细管辅助颗粒组装），被集成到微流体平台16中。蒸发液滴的半月板在微流体通道内的图案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物上后退时，施加毛细管力，将悬浮在液体中的单个胶体颗粒捕获到基板上微细加工的微孔中（图1A）。悬浮颗粒首先通过对流输送到气液界面，然后通过毛细管进入陷阱。与粒子相互作用中涉及的力相比，移动半月板施加的毛细管力的作用范围更大。
因此，装配机制不受颗粒的材料、尺寸和表面特性的影响。颗粒浓度、弯月板速度、温度和悬浮液表面张力等参数是影响图案化过程产量的唯一参数。读者可以在13，14，15中找到上述参数对图案化过程影响的详细说明。在最初的sCAPA技术13，14，15中，胶体图案化过程在开放系统中进行，并且需要高精度压电级来驱动悬架穿过模板。该平台利用不同的策略，并允许在受控环境中使用通常用于微流体的标准设备进行图案化，从而最大限度地降低污染样品的风险。
这种微流体平台首先在胶体颗粒上进行优化，以创建常规的惰性颗粒阵列，然后成功应用于细菌。本文描述了这两种微流体平台（图1B，C）。方案中描述的大多数准备步骤和实验设备对于这两种应用都是通用的（图2）。我们报告了胶体图案化，以证明该技术可用于在同一表面上执行多个顺序沉积，以创建复杂的多材料图案。特别是，每个陷阱每个步骤沉积一个颗粒，以形成具有特定几何形状和组成的胶体阵列，完全由陷阱的几何形状和填充顺序决定。至于细菌模式，描述了单个沉积，导致每个陷阱沉积一个细菌。一旦细胞在表面上被图案化，微流体通道就会被培养基冲洗以促进细菌生长，这是任何单细胞研究的初步步骤。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的微流体平台允许将微尺寸的物体（如胶体和细菌）图案化为PDMS底物上规定的空间排列。微流体对环境条件的完全控制以及sCAPA技术赋予的以微米精度对细胞进行图案化的能力使其成为未来生理学和生态学研究的非常有前途的平台。
在这项工作中提出的实验中，使用 材料表中报告的光刻胶实现了硅母版。但是，可以使用任何适合在所描述的尺寸范围内?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢SNSF PRIMA赠款179834（对E.S.），ETH研究资助ETH-15 17-1（R.S.）以及Gordon和Betty Moore基金会水生微生物共生研究员奖（授予GBMF9197）（R.S.）的支持。作者感谢Miguel Angel Fernandez-Rodriguez博士（西班牙格拉纳达大学）对细菌进行SEM成像和富有洞察力的讨论。作者感谢Jen Nguyen博士（加拿大不列颠哥伦比亚大学），Laura Alvarez博士（瑞士苏黎世联邦理工学院），Cameron Boggon博士（瑞士苏黎世联邦理工学院）和Fabio Grillo博士进行了富有洞察力的讨论。
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
