Summary

דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים

Published: November 04, 2021
doi:

Summary

אנו מציגים טכנולוגיה המשתמשת בהרכבה בסיוע נימי בפלטפורמה מיקרופלואידית כדי לעצב עצמים בגודל מיקרו המושעים בנוזל, כגון חיידקים וקוליואידים, למערכים שנקבעו על מצע פולידימתילסילוקסן.

Abstract

דפוס מבוקר של מיקרואורגניזמים לסידורים מרחביים מוגדרים מציע אפשרויות ייחודיות למגוון רחב של יישומים ביולוגיים, כולל מחקרים של פיזיולוגיה מיקרוביאלית ואינטראקציות. ברמה הפשוטה ביותר, דפוס מרחבי מדויק של מיקרואורגניזמים יאפשר הדמיה אמינה וארוכת טווח של מספר גדול של תאים בודדים וישנה את היכולת לחקור באופן כמותי אינטראקציות מיקרואורגניזמים תלויות מרחק. באופן ייחודי יותר, צימוד דפוס מרחבי מדויק ושליטה מלאה על התנאים הסביבתיים, כפי שמוצע על ידי טכנולוגיה מיקרופלואידית, יספק פלטפורמה רבת עוצמה ורב-תכליתית למחקרים של תאים חד-תאיים באקולוגיה מיקרוביאלית.

מאמר זה מציג פלטפורמה מיקרופלואידית לייצור דפוסים רב-תכליתיים ומוגדרים על-ידי המשתמש של מיקרואורגניזמים בתוך ערוץ מיקרופלואידי, המאפשרים גישה אופטית מלאה לניטור ארוך טווח בעל תפוקה גבוהה. טכנולוגיה מיקרופלואידית חדשה זו מבוססת על הרכבת חלקיקים בסיוע נימים ומנצלת את כוחות הנימים הנובעים מהתנועה המבוקרת של השעיה מתאדה בתוך ערוץ מיקרופלואידי להפקדת עצמים מיקרו-זעירים בודדים במערך של מלכודות שעברו מיקרו-פבריקאט על מצע פולידימתילסילוקסן (PDMS). תצהירים רציפים יוצרים את הפריסה המרחבית הרצויה של סוגים בודדים או מרובים של אובייקטים בגודל מיקרו, המוכתבים אך ורק על ידי הגיאומטריה של המלכודות ורצף המילוי.

הפלטפורמה כויל באמצעות חלקיקים קולואידיים מממדים וחומרים שונים: היא הוכיחה את עצמה ככלי רב עוצמה ליצירת דפוסים קולואידיים מגוונים ולבצע פונקציונליזציה של פני השטח של חלקיקים לכודים. יתר על כן, הפלטפורמה נבדקה על תאים מיקרוביאליים, באמצעות תאי קולי Escherichia כחיידק מודל. אלפי תאים בודדים עוצבו על פני השטח, וצמיחתם הייתה במעקב לאורך זמן. בפלטפורמה זו, צימוד של תצהיר חד-תאי וטכנולוגיה מיקרופלואידית מאפשר הן דפוס גיאומטרי של מיקרואורגניזמים והן שליטה מדויקת בתנאים הסביבתיים. כך הוא פותח צוהר לפיזיולוגיה של חיידקים בודדים ולאקולוגיה של אינטראקציות מיקרואורגניזמים, כפי שמוצג בניסויים ראשוניים.

Introduction

דפוס מרחבי של מיקרואורגניזמים בודדים, במיוחד בתוך זירות ניסיוניות המאפשרות שליטה מלאה על תנאים סביבתיים, כגון מכשירים מיקרופלואידיים, רצוי מאוד במגוון רחב של הקשרים. לדוגמה, סידור מיקרואורגניזמים למערכים קבועים יאפשר הדמיה מדויקת של מספר רב של תאים בודדים וחקר צמיחתם, פיזיולוגיה, ביטוי גנים בתגובה לגירויים סביבתיים ורגישות לתרופות. זה גם יאפשר ללמוד אינטראקציות תא-תאים של עניין מיוחד במחקר לתוך תקשורת סלולרית (למשל, חישת מניין), האכלה צולבת (למשל, סימביוזה אצות-חיידקיות), או אנטגוניזם (למשל, אלופתיה), עם שליטה מלאה על לוקליזציה מרחבית של תאים ביחס זה לזה. מחקרי פיזיולוגיה ואבולוציה של תאים1, מחקרי אינטראקציה בין תאים2, סינון בידול פנוטיפי3, ניטור סביבתי4 והסרת סמים5 הם בין התחומים שיכולים להפיק תועלת רבה מטכנולוגיה המסוגלת להשיג ניתוח כמותי כזה של תא בודד.

מספר אסטרטגיות לבודד ולטפל בתאים בודדים הוצעו בשנים האחרונות, החל ממלכודות אופטיות הולוגרפיות6 ושיטות פונקציונליזציה של פני השטח הטרוגניים7,8,9,10 ועד כימותרפיה חד-תאית11 ומיקרופלואידיקה טיפתית12. שיטות אלה הן תובעניות מאוד מבחינה טכנית או משפיעות על פיזיולוגיית התא ואינן מספקות פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה למיקרואורגניזמי דפוס שניתן ללמוד לאורך תקופות ארוכות, מה שמבטיח רזולוציה של תא יחיד, גישה אופטית מלאה ושליטה על התנאים הסביבתיים. מטרת מאמר זה היא לתאר פלטפורמה לתבנית חיידקים עם דיוק מיקרומטרי לסידורים מרחביים שנקבעו על משטח PDMS באמצעות הרכבה בסיוע נימים. פלטפורמה זו מאפשרת דפוס מרחבי מדויק וגמיש של חיידקים ומאפשרת גישה אופטית מלאה ושליטה על התנאים הסביבתיים, הודות לאופי המיקרופלואידי שלה.

הטכנולוגיה שמאחורי פלטפורמה זו היא טכנולוגיית הרכבה שפותחה בשנים האחרונות, בשם sCAPA13,14,15 (הרכבת חלקיקים בסיוע נימים רציפים) ששולבה בפלטפורמה מיקרופלואידית16. המניסקוס של טיפת נוזל מתאדה, בעודו נסוג מעל מצע פולידימתילסילוקסן (PDMS) בדוגמת פולידימתילסילוקסן (PDMS) בתוך ערוץ מיקרופלואידי, מפעיל כוחות נימיים הלוכדים את החלקיקים הקולואידיים הבודדים התלויים בנוזל לתוך בארות מיקרומטריות המיקרו-פבריות על המצע (איור 1A). חלקיקים מושעים מועברים תחילה לממשק נוזל האוויר על ידי זרמים קונבנציונליים ולאחר מכן ממוקמים לתוך המלכודות על ידי נימים. כוחות נימיים המופעלים על ידי פעולת המניסקוס הנע בקנה מידה גדול יותר בהשוואה לכוחות המעורבים באינטראקציות חלקיקים.

לפיכך, מנגנון ההרכבה אינו מושפע מהחומר, הממדים ומאפייני השטח של החלקיקים. פרמטרים כגון ריכוז חלקיקים, מהירות המניסקוס, הטמפרטורה ומתח פני השטח של ההשעיה הם הפרמטרים היחידים המשפיעים על התשואה של תהליך הדפוס. הקורא יכול למצוא תיאור מפורט של ההשפעה של הפרמטרים הנ”ל על תהליך הדפוס ב13,14,15. בטכנולוגיית sCAPA המקורית13,14,15, תהליך התבנית הקולואידית בוצע במערכת פתוחה ודרש שלב פיזואלקטרי ברמת דיוק גבוהה כדי להניע את המתלה על פני התבנית. פלטפורמה זו מנצלת אסטרטגיה שונה ומאפשרת לדפוס להתבצע עם ציוד סטנדרטי המשמש בדרך כלל במיקרופלואידיקה בסביבה מבוקרת, ובכך ממזערת את הסיכונים של זיהום הדגימות.

פלטפורמה מיקרופלואידית זו עברה אופטימיזציה תחילה על חלקיקים קולואידיים כדי ליצור מערכים קבועים של חלקיקים אינרטיים ולאחר מכן הוחלה בהצלחה על חיידקים. שתי הפלטפורמות המיקרופלואידיות מתוארות במאמר זה (איור 1B, C). רוב שלבי ההכנה והציוד הניסיוני המתואר בפרוטוקול נפוצים בשני היישומים (איור 2). אנו מדווחים על דפוס קולואידי כדי להדגים שניתן להשתמש בטכניקה לביצוע תצהירים רציפים מרובים על אותו משטח כדי ליצור דפוסים מורכבים ורב-חומריים. בפרט, חלקיק אחד בודד הופקד לכל מלכודת עבור כל שלב כדי ליצור מערכים קולואידיים עם גיאומטריה וקומפוזיציה ספציפיים, המוכתבים אך ורק על ידי הגיאומטריה ורצף המילוי של המלכודות. באשר לעיצוב חיידקי, תצהירים בודדים מתוארים, וכתוצאה מכך חיידק אחד מופקד לכל מלכודת. ברגע שתאים מעוצבים על פני השטח, הערוץ המיקרופלואידי נשטף במדיום כדי לקדם את צמיחת החיידקים, השלב הראשוני של כל מחקר של תא בודד.

Protocol

1. הכנה מאסטר סיליקון הערה: תבניות ה- PDMS הנושאות את המלכודות המיקרו-פבריקטיות היוצרות את התבנית עבור דפוס קולואידי ומיקרוביאלי מפוברקות מפוברקות בהתאם לשיטה שהוצגה על ידי Geissler et al. 17. מאסטר הסיליקון הוכן על ידי ליטוגרפיה קונבנציונלית בחדר נקי. …

Representative Results

פותחה פלטפורמה מיקרופלואידית המנצלת הרכבה בסיוע נימים כדי לעצב חלקיקים וחיידקים קולואידיים למלכודות שעברו מיקרו-פבריקט בתבנית PDMS. שתי גיאומטריות ערוץ שונות תוכננו כדי לייעל את התבנית של קולואידים וחיידקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות. הגיאומטריה של הערוץ הראשון (איור 1B) מ…

Discussion

הפלטפורמה המיקרופלואידית המתוארת כאן מאפשרת דפוס של עצמים בגודל מיקרו, כגון קולואידים וחיידקים, לסידורים מרחביים שנקבעו על מצע PDMS. השליטה המלאה על התנאים הסביבתיים המוצעים על ידי מיקרופלואידיקה והיכולת לעצב תאים עם דיוק מיקרומטרי המוענק על ידי טכנולוגיית sCAPA הופכת אותו לפלטפורמה מבטיחה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים בתמיכת מענק הפרימה של SNSF 179834 (ל- E.S.), מענק מחקר ETH-15 15 17-1 (R. S.), ופרס החוקר של קרן גורדון ובטי מור על סימביוזה מיקרוביאלית מימית (מענק GBMF9197) (R. S.). המחברים מודים לד”ר מיגל אנג’ל פרננדז-רודריגז (אוניברסיטת גרנדה, ספרד) על הדמיית SEM של חיידקים ועל הדיונים התובנות. המחברים מודים לד”ר ג’ן נגוין (אוניברסיטת קולומביה הבריטית, קנדה), ד”ר לורה אלוורז (ETH ציריך, שווייץ), קמרון בוגון (ETH ציריך, שווייץ) וד”ר פאביו גרילו על הדיונים התובנות.

Materials

Alcatel AMS 200SE I-Speeder Alcatel Micro Machining System deep reactive ion exchange system
Alconox detergent
AZ400K developer MicroChemicals AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator Life Imaging Services used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge Eppendorf 5424R used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M PVA TePla used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER Okolab controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS Okolab heated glass plate
Heidelberg DWL 2000 Heidelberg Instruments UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer Codan Medical ApS CODA621640 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout Opensource used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244610 Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x) Teknova M2101 diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments microscope
openSCAD Opensource used to design the mold
OPTIspin SB20 ATM group 51-0002-01-00 spin developer
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505 MicroChemicals AZ1505
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786 added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S Prusa used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin – Tough Prusa Research a.s. UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer Prusa used to print the mold
Scale VWR-CH 611-2605 used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc. N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich 448931 used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20 Sigma Aldrich P1379 used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M Veeco profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater MTI corporation vacuum spin coater

References

  1. Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
  2. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  3. Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
  4. Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
  5. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
  6. Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
  7. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
  8. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
  9. Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
  10. Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
  11. Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
  12. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  13. Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
  14. Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
  15. Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
  16. Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
  17. Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
  18. Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
  19. Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).

Play Video

Cite This Article
Pioli, R., Stocker, R., Isa, L., Secchi, E. Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (177), e63131, doi:10.3791/63131 (2021).

View Video