Summary

Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

Published: November 04, 2021
doi:

Summary

Presentiamo una tecnologia che utilizza l’assemblaggio assistito dalla capillarità in una piattaforma microfluidica per modellare oggetti di dimensioni micro sospesi in un liquido, come batteri e colloidi, in matrici prescritte su un substrato di polidimetilsilossano.

Abstract

La modellazione controllata dei microrganismi in disposizioni spaziali definite offre possibilità uniche per una vasta gamma di applicazioni biologiche, compresi studi di fisiologia microbica e interazioni. Al livello più semplice, un accurato pattern spaziale dei microrganismi consentirebbe l’imaging affidabile e a lungo termine di un gran numero di singole cellule e trasformerebbe la capacità di studiare quantitativamente le interazioni microbo-microbo dipendenti dalla distanza. Più unicamente, l’accoppiamento di modelli spaziali accurati e il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come offerto dalla tecnologia microfluidica, fornirebbe una piattaforma potente e versatile per studi su singole cellule in ecologia microbica.

Questo documento presenta una piattaforma microfluidica per produrre modelli versatili e definiti dall’utente di microrganismi all’interno di un canale microfluidico, consentendo un accesso ottico completo per il monitoraggio a lungo termine e ad alta produttività. Questa nuova tecnologia microfluidica si basa sull’assemblaggio di particelle assistito dalla capillarità e sfrutta le forze capillari derivanti dal movimento controllato di una sospensione evaporante all’interno di un canale microfluidico per depositare singoli oggetti di dimensioni micrometriche in una serie di trappole microfabbricate su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS). Le deposizioni sequenziali generano il layout spaziale desiderato di singoli o più tipi di oggetti di dimensioni micro, dettato esclusivamente dalla geometria delle trappole e dalla sequenza di riempimento.

La piattaforma è stata calibrata utilizzando particelle colloidali di diverse dimensioni e materiali: ha dimostrato di essere un potente strumento per generare diversi modelli colloidali ed eseguire la funzionalizzazione superficiale delle particelle intrappolate. Inoltre, la piattaforma è stata testata su cellule microbiche, utilizzando cellule di Escherichia coli come batterio modello. Migliaia di singole cellule sono state modellate sulla superficie e la loro crescita è stata monitorata nel tempo. In questa piattaforma, l’accoppiamento della deposizione monocellulare e della tecnologia microfluidica consente sia la modellazione geometrica dei microrganismi che il controllo preciso delle condizioni ambientali. Apre così una finestra sulla fisiologia dei singoli microbi e sull’ecologia delle interazioni microbo-microbo, come dimostrato da esperimenti preliminari.

Introduction

La modellazione spaziale di singoli microrganismi, in particolare all’interno di arene sperimentali che consentono il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come i dispositivi microfluidici, è altamente auspicabile in una vasta gamma di contesti. Ad esempio, organizzare i microrganismi in array regolari consentirebbe l’imaging accurato di un gran numero di singole cellule e lo studio della loro crescita, fisiologia, espressione genica in risposta a stimoli ambientali e suscettibilità ai farmaci. Consentirebbe inoltre di studiare le interazioni cellula-cellula di particolare interesse nella ricerca sulla comunicazione cellulare (ad esempio, quorum sensing), cross-feeding (ad esempio, simbiosi algale-batterica) o antagonismo (ad esempio, allelopatia), con pieno controllo sulla localizzazione spaziale delle cellule l’una rispetto all’altra. Gli studi di fisiologia ed evoluzione cellulare1, gli studi di interazione cellula-cellula2, lo screening fenotipico della differenziazione3, il monitoraggio ambientale4 e lo screening farmacologico5 sono tra i campi che possono trarre grande beneficio da una tecnologia in grado di ottenere tale analisi quantitativa a singola cellula.

Negli ultimi anni sono state proposte diverse strategie per isolare e gestire singole cellule, dalle trappole ottiche olografiche6 e metodi di funzionalizzazione di superficie eterogenei7,8,9,10 ai chemiostati monocellulari11 e alla microfluidica delle goccioline12. Questi metodi sono tecnicamente molto impegnativi o influenzano la fisiologia cellulare e non riescono a fornire una piattaforma ad alto rendimento per modellare i microbi che possono essere studiati per lunghi periodi, garantendo la risoluzione a singola cellula, il pieno accesso ottico e il controllo sulle condizioni ambientali. L’obiettivo di questo documento è descrivere una piattaforma per modellare i batteri con precisione micrometrica in disposizioni spaziali prescritte su una superficie PDMS attraverso l’assemblaggio assistito dalla capillarità. Questa piattaforma consente una modellazione spaziale precisa e flessibile dei microbi e consente l’accesso ottico completo e il controllo delle condizioni ambientali, grazie alla sua natura microfluidica.

La tecnologia alla base di questa piattaforma è una tecnologia di assemblaggio sviluppata negli ultimi anni, denominata sCAPA13,14,15 (sequenziale capillarity-assisted particle assembly) che è stata integrata in una piattaforma microfluidica16. Il menisco di una goccia liquida evaporante, mentre si ritira su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) modellato all’interno di un canale microfluidico, esercita forze capillari che intrappolano le singole particelle colloidali sospese nel liquido in pozzi micrometrici microfabbricati sul substrato (Figura 1A). Le particelle sospese vengono prima trasportate all’interfaccia aria-liquido da correnti convettive e quindi collocate nelle trappole per capillarità. Le forze capillari esercitate dal menisco in movimento agiscono su una scala più ampia rispetto alle forze coinvolte nelle interazioni particellarie.

Pertanto, il meccanismo di assemblaggio non è influenzato dal materiale, dalle dimensioni e dalle proprietà superficiali delle particelle. Parametri come la concentrazione delle particelle, la velocità del menisco, la temperatura e la tensione superficiale della sospensione sono gli unici parametri che influenzano la resa del processo di patterning. Il lettore può trovare una descrizione dettagliata dell’influenza dei suddetti parametri sul processo di patterning in13,14,15. Nella tecnologia sCAPA originale13,14,15, il processo di pattern colloidale veniva eseguito in un sistema aperto e richiedeva uno stadio piezoelettrico ad alta precisione per guidare la sospensione attraverso il modello. Questa piattaforma sfrutta una strategia diversa e consente di effettuare il patterning con apparecchiature standard generalmente utilizzate in microfluidica in ambiente controllato, riducendo così al minimo i rischi di contaminazione dei campioni.

Questa piattaforma microfluidica è stata inizialmente ottimizzata su particelle colloidali per creare matrici regolari di particelle inerti e poi applicata con successo ai batteri. Entrambe le piattaforme microfluidiche sono descritte in questo articolo (Figura 1B,C). La maggior parte delle fasi preparatorie e le apparecchiature sperimentali descritte nel protocollo sono comuni per le due applicazioni (Figura 2). Riportiamo modelli colloidali per dimostrare che la tecnica può essere utilizzata per eseguire più deposizioni sequenziali sulla stessa superficie per creare modelli complessi e multimateriali. In particolare, una singola particella è stata depositata per trappola per ogni passo per formare matrici colloidali con una geometria e una composizione specifiche, dettate esclusivamente dalla geometria e dalla sequenza di riempimento delle trappole. Per quanto riguarda il pattern batterico, vengono descritte singole deposizioni, con conseguente deposito di un batterio per trappola. Una volta che le cellule sono modellate sulla superficie, il canale microfluidico viene lavato con il mezzo per promuovere la crescita batterica, la fase preliminare di qualsiasi studio a singola cellula.

Protocol

1. Preparazione del master del silicio NOTA: I modelli PDMS con le trappole microfabbricate che formano il modello per il pattern colloidale e microbico sono stati fabbricati secondo il metodo introdotto da Geissler et al. 17. Il master in silicio è stato preparato con la litografia convenzionale in una camera bianca. Vedere i seguenti passaggi per la procedura e la tabella dei materiali per l’apparecchiatura. <…

Representative Results

È stata sviluppata una piattaforma microfluidica che sfrutta l’assemblaggio assistito dalla capillarità per modellare particelle colloidali e batteri in trappole microfabbricate su un modello PDMS. Due diverse geometrie di canale sono state progettate per ottimizzare il pattern di colloidi e batteri attraverso l’assemblaggio assistito dalla capillarità. La geometria del primo canale (Figura 1B) è costituita da tre sezioni parallele lunghe 23 mm senza barriere fisiche tra di loro. Le due …

Discussion

La piattaforma microfluidica qui descritta consente la modellazione di oggetti di dimensioni micro, come colloidi e batteri, in disposizioni spaziali prescritte su un substrato PDMS. Il pieno controllo sulle condizioni ambientali offerto dalla microfluidica e la capacità di modellare le cellule con precisione micrometrica garantita dalla tecnologia sCAPA lo rendono una piattaforma molto promettente per futuri studi di fisiologia ed ecologia.

Negli esperimenti presentati in questo lavoro, il m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il sostegno della sovvenzione SNSF PRIMA 179834 (a E.S.), una sovvenzione di ricerca ETH ETH-15 17-1 (R. S.) e un Gordon and Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (sovvenzione GBMF9197) (R. S.). Gli autori ringraziano il Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Università di Granada, Spagna) per l’imaging SEM dei batteri e per le discussioni approfondite. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Jen Nguyen (Università della British Columbia, Canada), la Dott.ssa Laura Alvarez (ETH zurigo, Svizzera), Cameron Boggon (ETH Zurigo, Svizzera) e il Dott. Fabio Grillo per le discussioni approfondite.

Materials

Alcatel AMS 200SE I-Speeder Alcatel Micro Machining System deep reactive ion exchange system
Alconox detergent
AZ400K developer MicroChemicals AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator Life Imaging Services used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge Eppendorf 5424R used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M PVA TePla used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER Okolab controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS Okolab heated glass plate
Heidelberg DWL 2000 Heidelberg Instruments UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer Codan Medical ApS CODA621640 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout Opensource used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244610 Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x) Teknova M2101 diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments microscope
openSCAD Opensource used to design the mold
OPTIspin SB20 ATM group 51-0002-01-00 spin developer
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505 MicroChemicals AZ1505
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786 added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S Prusa used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin – Tough Prusa Research a.s. UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer Prusa used to print the mold
Scale VWR-CH 611-2605 used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc. N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich 448931 used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20 Sigma Aldrich P1379 used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M Veeco profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater MTI corporation vacuum spin coater

References

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Cite This Article
Pioli, R., Stocker, R., Isa, L., Secchi, E. Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (177), e63131, doi:10.3791/63131 (2021).

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