순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝
Summary
우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.
Abstract
정의된 공간 배열로 미생물의 통제된 패터닝은 미생물 생리학 및 상호 작용의 연구를 포함하여 생물학 응용의 넓은 범위에 대한 독특한 가능성을 제공합니다. 가장 간단한 수준에서, 미생물의 정확한 공간 패터닝은 개별 세포의 많은 수의 믿을 수 있고 장기적인 화상 진찰을 가능하게 하고 거리 의존적인 미생물 상호 작용을 정량적으로 공부하는 기능을 변환할 것입니다. 보다 유일하게, 미세유체 기술이 제공하는 바와 같이 정확한 공간 패터닝과 환경 조건에 대한 완전한 제어를 결합하면 미생물 생태학의 단일 세포 연구를 위한 강력하고 다재다능한 플랫폼을 제공할 것입니다.
이 논문은 미생물 채널 내에서 다재다능하고 사용자 정의한 미생물 패턴을 생성하는 미세 유체 플랫폼을 제공하여 장기적이고 높은 처리량 모니터링을 위한 완벽한 광학 액세스를 제공합니다. 이 새로운 미세 유체 기술은 모세혈관 보조 입자 조립을 기반으로 하며 미세 유체 채널 내부의 증발 현탁액의 제어된 모션으로 발생하는 모세관력을 악용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판에 미세매단된 트랩 배열에 개별 미세 크기의 물체를 증착합니다. 순차 적 기탁은 트랩의 형상및 충진 시퀀스에 의해서만 지시되는 단일 또는 다중 유형의 마이크로 크기의 객체의 원하는 공간 레이아웃을 생성합니다.
플랫폼은 다양한 치수와 재료의 콜로이드 입자를 사용하여 보정되었습니다 : 그것은 다양한 콜로이드 패턴을 생성하고 갇힌 입자의 표면 기능화를 수행하는 강력한 도구로 입증되었습니다. 더욱이, 플랫폼은 모델 박테리아로 대장균 세포를 사용하여 미생물 세포에서 시험되었다. 수천 개의 개별 세포가 표면에 패턴화되었고 시간이 지남에 따라 성장을 모니터링했습니다. 이 플랫폼에서 단일 세포 증착 및 미세 유체 기술의 결합을 통해 미생물의 기하학적 패턴화와 환경 조건의 정밀한 제어를 모두 허용합니다. 그것은 이렇게 단 하나 세균의 생리학 및 예비 실험에 의해 도시된 세균 성 상호 작용의 생태로 창을 엽니다.
Introduction
단일 미생물의 공간 패터닝, 특히 미세 유체 장치와 같은 환경 조건을 완전히 제어 할 수있는 실험 분야 내에서 광범위한 맥락에서 매우 바람직합니다. 예를 들어, 미생물을 정규 배열로 배열하면 많은 수의 개별 세포와 그들의 성장, 생리학, 환경 자극에 대한 반응의 유전자 발현 및 약물 감수성에 대한 연구의 정확한 이미징을 허용할 것입니다. 또한 세포 통신(예를 들어, 쿼럼 센싱), 교차 공급(예를 들어, 조류 세균 공생증) 또는 길항성(예를 들어, 알로파증)으로 연구에 특히 관심이 있는 세포 상호 작용을 연구할 수 있으며, 서로 에 비해 세포의 공간 국산화를 완전히 제어할 수 있습니다. 세포 생리학 및 진화 연구1, 세포 세포 상호 작용 연구2, 표현형 분화 스크리닝3, 환경 모니터링4 및 약물 스크리닝5 는 이러한 정량적 단일 세포 분석을 달성 할 수있는 기술로부터 크게 혜택을 누릴 수있는 분야 중 하나입니다.
단일 세포를 분리하고 처리하기 위한 몇 가지 전략이 최근 몇 년 동안 제안되었으며, 홀로그램 광학 트랩6 및 이질표면 기능화 방법7,8,9,10 ~ 단일 세포 chemostats11 및 액적 미세 유체12. 이러한 방법은 기술적으로 매우 까다롭거나 세포 생리학에 영향을 미치며 장기간 연구할 수 있는 미생물을 패턴화하는 고처리량 플랫폼을 제공하지 못하여 단일 세포 해상도, 완전한 광학 액세스 및 환경 조건에 대한 제어를 보장합니다. 이 논문의 목표는 모세관 보조 어셈블리를 통해 PDMS 표면의 소정의 공간 배열로 미세 메트릭 정밀도로 박테리아를 패턴화하는 플랫폼을 설명하는 것입니다. 이 플랫폼은 미생물의 정밀하고 유연한 공간 패터닝을 허용하고 미세유체 특성 덕분에 환경 조건에 대한 완전한 광학 액세스 및 제어기능을 가능하게 합니다.
이 플랫폼의 이면에 있는 기술은 최근 몇 년 동안 개발된 조립 기술으로, 미세유체 플랫폼에 통합된 sCAPA13,14,15(순차 모세혈관 지원 입자 조립)입니다. 증발하는 액체 액적의 반월 상연은, 미세유체 채널 내부의 패턴 폴리디메틸실록산(PDMS) 기판을 후퇴시키면서, 액체에 매달린 개별 콜로이드 입자를 기판에 미세하게 변형된 미세메트릭 우물(도 1A)으로 트랩하는 모세관력을 발휘한다. 일시 중단된 입자는 먼저 대류 전류에 의해 공기-액체 인터페이스로 이송된 다음 모세관에 의해 트랩에 배치됩니다. 움직이는 반월상 연골에 의해 가해지는 모세관력은 입자 상호 작용에 관여하는 힘에 비해 더 큰 규모로 작용합니다.
따라서, 어셈블리 메커니즘은 입자의 재료, 치수 및 표면 특성에 의해 영향을 받지 않는다. 입자 농도, 반월상 연골의 속도, 온도 및 서스펜션의 표면 장력과 같은 파라미터는 패터닝 공정의 수율에 영향을 미치는 유일한 파라미터입니다. 독자는 13,14,15에서 패터닝 공정에 앞서 언급한 매개 변수의 영향에 대한 자세한 설명을 찾을 수 있습니다. 원래 sCAPA 기술13,14,15에서, 콜로이드 패터닝 공정은 개방형 시스템에서 수행되었고 템플릿을 가로질러 서스펜션을 구동하기 위해 고정밀 압전 단계가 필요했습니다. 이 플랫폼은 다른 전략을 악용하고 제어 된 환경에서 일반적으로 미세 유체에 사용되는 표준 장비로 패터닝을 수행 할 수 있으므로 샘플을 오염시킬 위험을 최소화합니다.
이 미세 유체 플랫폼은 먼저 콜로이드 입자에 최적화되어 불활성 입자의 정기적 인 배열을 만든 다음 박테리아에 성공적으로 적용되었습니다. 두 미세 유체 플랫폼은 이 백서에 설명되어 있습니다(그림 1B, C). 프로토콜에 기재된 대부분의 준비 단계 및 실험 장비는 두 응용 프로그램에 대해 공통적입니다(그림 2). 콜로이드 패터닝을 보고하여 이 기술을 사용하여 동일한 표면에서 여러 순차 적 기탁을 수행하여 복잡하고 다중 물질적인 패턴을 만들 수 있음을 입증합니다. 특히, 트랩의 형상 및 충진 시퀀스에 의해서만 지시된 특정 형상 및 컴포지션을 가진 콜로이드 어레이를 형성하기 위해 각 단계에 대해 트랩당 하나의 단일 입자가 증착되었다. 세균 패턴에 관해서는, 단일 기탁이 설명되어 트랩 당 하나의 박테리아가 증착됩니다. 일단 세포가 표면에 패턴화되면, 미세 유체 채널은 세균 성장을 촉진하기 위해 매체로 플러시된다, 어떤 단일 세포 연구의 예비 단계.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 미세유체 플랫폼은 콜로이드 및 박테리아와 같은 마이크로 크기의 물체를 PDMS 기판에 규정된 공간 배열로 패터닝할 수 있게 합니다. 미세 유체학이 제공하는 환경 조건과 sCAPA 기술로 부여된 미세 메트릭 정밀도로 세포를 패턴화하는 능력은 미래의 생리학 및 생태 연구를 위한 매우 유망한 플랫폼입니다.
이 작품에 제시된 실험에서 실리콘 마스터는 재료?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 SNSF PRIMA 보조금 179834 (E.S.), ETH 연구 보조금 ETH-15 17-1 (R. S.), 수생 미생물 심바이오시스 (보조금 GBMF9197) (R. S.)에 대한 고든과 베티 무어 재단 조사관 상을 인정합니다. 저자는 박테리아의 SEM 화상 진찰및 통찰력 있는 토론을 위한 박사 미겔 엔젤 페르난데스-로드리게스 (그라나다 대학, 스페인) 감사합니다. 저자들은 젠 응우옌 박사(캐나다 브리티시 컬럼비아 대학), 로라 알바레즈 박사(스위스 ETH 취리히), 카메론 보곤(ETH 취리히, 스위스), 파비오 그릴로 박사에게 감사의 인사를 전합니다.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
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