Mønster af mikroorganismer og mikropartikler gennem sekventiel kapillaritetsassisteret samling
Summary
Vi præsenterer en teknologi, der bruger kapillaritetsassisteret samling i en mikrofluidisk platform til at mønstre objekter i mikrostørrelse suspenderet i en væske, såsom bakterier og kolloider, i foreskrevne arrays på et polydimethylsiloxansubstrat.
Abstract
Kontrolleret mønster af mikroorganismer i definerede rumlige arrangementer giver unikke muligheder for en bred vifte af biologiske anvendelser, herunder studier af mikrobiel fysiologi og interaktioner. På det enkleste niveau vil nøjagtig rumlig mønsterdannelse af mikroorganismer muliggøre pålidelig, langsigtet billeddannelse af et stort antal individuelle celler og transformere evnen til kvantitativt at studere afstandsafhængige mikrobe-mikrobe-interaktioner. Mere unikt er det, at kobling af nøjagtige rumlige mønstre og fuld kontrol over miljøforholdene, som tilbydes af mikrofluidisk teknologi, ville give en kraftfuld og alsidig platform for enkeltcellestudier inden for mikrobiel økologi.
Dette papir præsenterer en mikrofluidisk platform til fremstilling af alsidige og brugerdefinerede mønstre af mikroorganismer inden for en mikrofluidisk kanal, hvilket muliggør fuldstændig optisk adgang til langsigtet overvågning med høj gennemstrømning. Denne nye mikrofluidiske teknologi er baseret på kapillaritetsassisteret partikelsamling og udnytter kapillærkræfterne, der opstår som følge af den kontrollerede bevægelse af en fordampende suspension inde i en mikrofluidisk kanal til at deponere individuelle mikrostørrelsesobjekter i en række fælder, der er mikrofabrikeret på et polydimethylsiloxan (PDMS) substrat. Sekventielle aflejringer genererer det ønskede rumlige layout af enkelte eller flere typer objekter i mikrostørrelse, der udelukkende dikteres af fældernes geometri og påfyldningssekvensen.
Platformen er kalibreret ved hjælp af kolloide partikler af forskellige dimensioner og materialer: det har vist sig at være et kraftfuldt værktøj til at generere forskellige kolloide mønstre og udføre overfladefunktionalisering af fangede partikler. Desuden blev platformen testet på mikrobielle celler ved hjælp af Escherichia coli-celler som modelbakterie. Tusindvis af individuelle celler blev mønstret på overfladen, og deres vækst blev overvåget over tid. I denne platform muliggør koblingen af enkeltcelleaflejring og mikrofluidisk teknologi både geometrisk mønster af mikroorganismer og præcis kontrol af miljøforholdene. Det åbner således et vindue ind i fysiologien af enkelte mikrober og økologien af mikrobe-mikrobe interaktioner, som det fremgår af foreløbige eksperimenter.
Introduction
Rumligt mønster af enkelte mikroorganismer, især inden for eksperimentelle arenaer, der muliggør fuld kontrol over miljøforholdene, såsom mikrofluidiske enheder, er yderst ønskeligt i en lang række sammenhænge. For eksempel ville arrangering af mikroorganismer i regelmæssige arrays muliggøre nøjagtig billeddannelse af et stort antal individuelle celler og undersøgelse af deres vækst, fysiologi, genekspression som reaktion på miljømæssige stimuli og lægemiddelmodtagelighed. Det ville også gøre det muligt at studere celle-celle-interaktioner af særlig interesse for forskning i cellulær kommunikation (f.eks. Quorum sensing), krydsfodring (f.eks. Alge-bakteriel symbiose) eller antagonisme (f.eks. Allelopati) med fuld kontrol over den rumlige lokalisering af celler i forhold til hinanden. Cellefysiologi og evolutionsstudier1, celle-celle-interaktionsstudier2, fænotypisk differentieringsscreening3, miljøovervågning4 og lægemiddelscreening5 er blandt de områder, der i høj grad kan drage fordel af en teknologi, der er i stand til at opnå en sådan kvantitativ enkeltcelleanalyse.
Flere strategier til isolering og håndtering af enkeltceller er blevet foreslået i de senere år, fra holografiske optiske fælder6 og heterogene overfladefunktionaliseringsmetoder7,8,9,10 til enkeltcellekemostaterne11 og dråbemikrofluidik12. Disse metoder er enten teknisk meget krævende eller påvirker cellefysiologien og giver ikke en platform med høj gennemstrømning til mønstermikrober, der kan studeres over lange perioder, hvilket sikrer enkeltcelleopløsning, fuld optisk adgang og kontrol over miljøforholdene. Målet med dette papir er at beskrive en platform til at mønstre bakterier med mikrometrisk præcision i foreskrevne rumlige arrangementer på en PDMS-overflade gennem kapillaritetsassisteret samling. Denne platform muliggør præcis og fleksibel rumlig mønster af mikrober og muliggør fuld optisk adgang og kontrol over miljøforholdene takket være dens mikrofluidiske natur.
Teknologien bag denne platform er en monteringsteknologi, der er udviklet i de senere år, ved navn sCAPA13,14,15 (sekventiel kapillaritetsassisteret partikelsamling), der blev integreret i en mikrofluidisk platform16. Menisken af en fordampende flydende dråbe, mens den trækker sig tilbage over et mønstret polydimethylsiloxan (PDMS) substrat inde i en mikrofluidisk kanal, udøver kapillærkræfter, der fanger de enkelte kolloide partikler suspenderet i væsken i mikrometriske brønde mikrofabrikeret på substratet (figur 1A). Suspenderede partikler transporteres først til luft-væske-grænsefladen ved hjælp af konvektive strømme og placeres derefter i fælderne ved kapillaritet. Kapillærkræfter, der udøves af den bevægelige menisk, virker i større skala sammenlignet med kræfter involveret i partikelinteraktioner.
Således påvirkes monteringsmekanismen ikke af partiklernes materiale, dimensioner og overfladeegenskaber. Parametre som partikelkoncentration, hastigheden af menisken, temperaturen og overfladespændingen af suspensionen er de eneste parametre, der påvirker udbyttet af mønsterprocessen. Læseren kan finde en detaljeret beskrivelse af de førnævnte parametres indflydelse på mønsterprocessen i13,14,15. I den oprindelige sCAPA-teknologi13,14,15 blev den kolloide mønsterproces udført i et åbent system og krævede et piezoelektrisk trin med høj præcision for at drive suspensionen på tværs af skabelonen. Denne platform udnytter en anden strategi og gør det muligt at udføre mønstret med standardudstyr, der generelt anvendes i mikrofluidik i et kontrolleret miljø, hvilket minimerer risikoen for at forurene prøverne.
Denne mikrofluidiske platform blev først optimeret på kolloide partikler for at skabe regelmæssige arrays af inerte partikler og derefter med succes anvendt på bakterier. Begge mikrofluidiske platforme er beskrevet i dette papir (figur 1B,C). De fleste af de forberedende trin og det eksperimentelle udstyr, der er beskrevet i protokollen, er fælles for de to applikationer (figur 2). Vi rapporterer kolloidt mønster for at demonstrere, at teknikken kan bruges til at udføre flere sekventielle aflejringer på samme overflade for at skabe komplekse, multimaterialemønstre. Især blev en enkelt partikel deponeret pr. fælde for hvert trin for at danne kolloide arrays med en specifik geometri og sammensætning, udelukkende dikteret af fældernes geometri og påfyldningssekvens. Med hensyn til bakteriemønster beskrives enkeltaflejringer, hvilket resulterer i, at en bakterie deponeres pr. Fælde. Når celler er mønstret på overfladen, skylles den mikrofluidiske kanal med medium for at fremme bakterievækst, det indledende trin i enhver enkeltcelleundersøgelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mikrofluidiske platform, der er beskrevet her, tillader mønster af objekter i mikrostørrelse, såsom kolloider og bakterier, i foreskrevne rumlige arrangementer på et PDMS-substrat. Den fulde kontrol over miljøforholdene, der tilbydes af mikrofluidik, og evnen til at mønstre celler med mikrometrisk præcision givet af sCAPA-teknologi gør det til en meget lovende platform for fremtidige fysiologiske og økologiske undersøgelser.
I de eksperimenter, der blev præsenteret i dette arbej…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtte fra SNSF PRIMA grant 179834 (til ES), et ETH Research Grant ETH-15 17-1 (RS) og en Gordon og Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). Forfatterne takker Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (University of Granada, Spanien) for SEM-billeddannelse af bakterier og for de indsigtsfulde diskussioner. Forfatterne takker Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Canada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Schweiz), Cameron Boggon (ETH Zürich, Schweiz) og Dr. Fabio Grillo for de indsigtsfulde diskussioner.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
