Mönstra av mikroorganismer och mikropartiklar genom sekventiell kapillärstödd montering
Summary
Vi presenterar en teknik som använder kapillärassisterad montering i en mikrofluidisk plattform för att mönster mikrostora föremål upphängda i en vätska, såsom bakterier och kolloider, i föreskrivna matriser på ett polydimethylsiloxan substrat.
Abstract
Kontrollerad mönstra av mikroorganismer i definierade rumsliga arrangemang erbjuder unika möjligheter för ett brett spektrum av biologiska tillämpningar, inklusive studier av mikrobiell fysiologi och interaktioner. På den enklaste nivån skulle noggrann rumslig mönstra av mikroorganismer möjliggöra tillförlitlig, långsiktig avbildning av ett stort antal enskilda celler och omvandla förmågan att kvantitativt studera avståndsberoende mikrob-mikrobinteraktioner. Mer unikt är att koppling av noggrann rumslig mönstra och full kontroll över miljöförhållanden, som erbjuds av mikrofluidisk teknik, skulle ge en kraftfull och mångsidig plattform för encelliga studier i mikrobiell ekologi.
Detta dokument presenterar en mikrofluidisk plattform för att producera mångsidiga och användardefinierade mönster av mikroorganismer inom en mikrofluidisk kanal, vilket möjliggör fullständig optisk åtkomst för långsiktig övervakning med hög genomströmning. Denna nya mikrofluidiska teknik är baserad på kapillärassisterad partikelmontering och utnyttjar kapillärkrafterna som härrör från den kontrollerade rörelsen hos en avdunstningsfjädring inuti en mikrofluidisk kanal för att deponera enskilda mikrosiserade föremål i en rad fällor som mikrofabriceras på ett polydimethylsiloxan (PDMS) substrat. Sekventiella depositioner genererar önskad rumslig layout för enstaka eller flera typer av mikrostora objekt, dikterade enbart av fällornas geometri och fyllningssekvensen.
Plattformen har kalibrerats med hjälp av kolloidala partiklar av olika dimensioner och material: den har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att generera olika kolloidala mönster och utföra ytfunktionalisering av fångade partiklar. Dessutom testades plattformen på mikrobiella celler, med Escherichia coli-celler som modellbakteri. Tusentals enskilda celler mönstrades på ytan, och deras tillväxt övervakades över tiden. I denna plattform möjliggör kopplingen av encellsdeposition och mikrofluidisk teknik både geometrisk mönstra av mikroorganismer och exakt kontroll av miljöförhållanden. Det öppnar således ett fönster in i fysiologin hos enskilda mikrober och ekologin hos mikrobmikroberinteraktioner, vilket framgår av preliminära experiment.
Introduction
Rumslig mönstra av enskilda mikroorganismer, särskilt inom experimentella arenor som möjliggör full kontroll över miljöförhållanden, såsom mikrofluidiska anordningar, är mycket önskvärd i ett brett spektrum av sammanhang. Till exempel skulle arrangera mikroorganismer i regelbundna matriser möjliggöra korrekt avbildning av ett stort antal enskilda celler och studier av deras tillväxt, fysiologi, genuttryck som svar på miljöstimuli och läkemedelskänslighet. Det skulle också göra det möjligt att studera cellcellsinteraktioner av särskilt intresse för forskning om cellulär kommunikation (t.ex. kvorumavkänning), korsmatning (t.ex. alg-bakteriell symbios) eller antagonism (t.ex. allelopathy), med full kontroll över den rumsliga lokaliseringen av celler i förhållande till varandra. Cellfysiologi och evolutionsstudier1, cell-cellinteraktionsstudier2, fenotypisk differentieringsscreening3, miljöövervakning4 och läkemedelsscreening5 är några av de områden som kan dra stor nytta av en teknik som kan uppnå sådan kvantitativ encellsanalys.
Flera strategier för att isolera och hantera enskilda celler har föreslagits under de senaste åren, från holografiska optiska fällor6 och heterogena ytfunktionaliseringsmetoder7,8,9,10 till encelliga chemostats11 och droplet microfluidics12. Dessa metoder är antingen tekniskt mycket krävande eller påverkar cellfysiologi och misslyckas med att tillhandahålla en plattform med hög genomströmning för att mönstermikrober som kan studeras under långa perioder, vilket säkerställer encellsupplösning, fullständig optisk åtkomst och kontroll över miljöförhållanden. Målet med detta dokument är att beskriva en plattform för att mönster bakterier med mikrometrisk precision i föreskrivna rumsliga arrangemang på en PDMS-yta genom kapillärstödd montering. Denna plattform möjliggör exakt och flexibel rumslig mönskning av mikrober och möjliggör full optisk åtkomst och kontroll över miljöförhållanden, tack vare dess mikrofluidiska natur.
Tekniken bakom denna plattform är en monteringsteknik som utvecklats under de senaste åren, kallad sCAPA13,14,15 (sekventiell kapillärstödd partikelmontering) som integrerades i en mikrofluidisk plattform16. Menisken hos en avdunstning flytande droppe, samtidigt som den avtar över ett mönstrat polydimethylsiloxan (PDMS) substrat inuti en mikrofluidisk kanal, utövar kapillärkrafter som fångar de enskilda kolloidala partiklarna upphängda i vätskan i mikrometriska brunnar mikrofabricerade på substratet (figur 1A). Suspenderade partiklar transporteras först till luft-vätskegränssnittet av konvektiva strömmar och placeras sedan i fällorna av kapillärhet. Kapillärkrafter som utövas av den rörliga menisken verkar i större skala jämfört med krafter involverade i partikelinteraktioner.
Monteringsmekanismen påverkas således inte av partiklarnas material, dimensioner och ytegenskaper. Parametrar som partikelkoncentration, meniskens hastighet, temperatur och ytspänningen i suspensionen är de enda parametrarna som påverkar mönstraringsprocessens utbyte. Läsaren kan hitta en detaljerad beskrivning av de ovan nämnda parametrarnas påverkan på mönseringsprocessen i 13,14,15. I den ursprungliga sCAPA-tekniken13,14,15 utfördes den kolloidala mönstraringsprocessen i ett öppet system och krävde ett piezoelektriskt stadium med hög precision för att driva fjädringen över mallen. Denna plattform utnyttjar en annan strategi och gör det möjligt att utföra mönstrar med standardutrustning som vanligtvis används i mikrofluidik i en kontrollerad miljö, vilket minimerar riskerna för att förorena proverna.
Denna mikrofluidiska plattform optimerades först på kolloidala partiklar för att skapa regelbundna matriser av inerta partiklar och sedan framgångsrikt appliceras på bakterier. Båda mikrofluidiska plattformarna beskrivs i detta dokument (figur 1B,C). De flesta förberedande stegen och den experimentella utrustning som beskrivs i protokollet är gemensamma för de två tillämpningarna (figur 2). Vi rapportera kolloidal mönstrar för att visa att tekniken kan användas för att utföra flera sekventiella depositioner på samma yta för att skapa komplexa, multimaterial mönster. I synnerhet deponerades en enda partikel per fälla för varje steg för att bilda kolloidala matriser med en specifik geometri och sammansättning, endast dikterad av fällornas geometri och fyllningssekvens. När det gäller bakteriell mönstrad beskrivs enskilda depositioner, vilket resulterar i att en bakterie deponeras per fälla. När cellerna är mönstrade på ytan spolas den mikrofluidiska kanalen med medium för att främja bakterietillväxt, det preliminära steget i en encellsstudie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mikrofluidiska plattformen som beskrivs här gör det möjligt att mönstra mikrostora föremål, såsom kolloider och bakterier, i föreskrivna rumsliga arrangemang på ett PDMS-substrat. Den fulla kontrollen över miljöförhållanden som erbjuds av mikrofluidik och förmågan att mönstera celler med mikrometrisk precision som beviljas av sCAPA-teknik gör det till en mycket lovande plattform för framtida fysiologi- och ekologistudier.
I experimenten som presenterades i detta arbete re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna bekräftar stöd från SNSF PRIMA grant 179834 (till E.S.), ett ETH Research Grant ETH-15 17-1 (R. S.), och en Gordon och Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). Författarna tackar Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (University of Granada, Spanien) för SEM-avbildningen av bakterier och för de insiktsfulla diskussionerna. Författarna tackar Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Kanada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Schweiz), Cameron Boggon (ETH Zürich, Schweiz) och Dr. Fabio Grillo för de insiktsfulla diskussionerna.
Materials
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin – Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
