Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक अर्ध-लक्षित क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि का उपयोग करके प्लाज्मा में फेनोलिक मेटाबोलाइट्स का पता लगाना है।
Abstract
23 बुजुर्ग व्यक्तियों के एक समूह को कार्यात्मक भोजन (एक पेय और एक मफिन) विशेष रूप से सरकोपेनिया (मांसपेशियों के द्रव्यमान की उम्र से संबंधित हानि) की रोकथाम के लिए तैयार किया गया था। प्लाज्मा के नमूने हस्तक्षेप की शुरुआत में और कार्यात्मक भोजन का उपभोग करने के 30 दिनों के बाद लिए गए थे। फेनोलिक यौगिकों और उनके चयापचयों की पहचान करने के लिए अग्रानुक्रम द्रव्यमान (यूपीएलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण के साथ युग्मित एक अर्ध-लक्षित अल्ट्रा-उच्च-प्रदर्शन क्रोमैटोग्राफी किया गया था। प्लाज्मा प्रोटीन इथेनॉल के साथ अवक्षेपित किए गए थे और नमूनों को यूपीएलसी-एमएस / एमएस उपकरण में इंजेक्शन से पहले मोबाइल चरण (1: 1 एसिटोनिट्राइल: पानी) में केंद्रित और पुन: निलंबित कर दिया गया था। पृथक्करण को एक C18 रिवर्स-फेज कॉलम के साथ किया गया था, और यौगिकों को उनके प्रयोगात्मक द्रव्यमान, आइसोटोपिक वितरण और टुकड़ा पैटर्न का उपयोग करके पहचाना गया था। ब्याज के यौगिकों की तुलना डेटा बैंकों और आंतरिक अर्ध-लक्षित पुस्तकालय के उन लोगों से की गई थी। प्रारंभिक परिणामों से पता चला है कि हस्तक्षेप के बाद पहचाने जाने वाले प्रमुख मेटाबोलाइट्स फेनिलएसिटिक एसिड, ग्लाइसिटिन, 3-हाइड्रॉक्सीफेनाइलवेलेरिक एसिड और गोमिसिन एम 2 थे।
Introduction
सरकोपेनिया एक प्रगतिशील कंकाल विकार है जो बुजुर्ग आबादी में मांसपेशियों के त्वरित नुकसान से संबंधित है। यह स्थिति गिरने के जोखिम को बढ़ाती है और दैनिक जीवन की सीमित गतिविधियों की ओर ले जाती है। सरकोपेनिया 65 वर्ष से अधिक आयु के लगभग 5% -10% व्यक्तियों और 80 वर्ष या उससे अधिक आयु के लगभग 50% व्यक्तियों में मौजूद है। सरकोपेनिया के उपचार के लिए कोई विशिष्ट दवाओं को अनुमोदित नहीं किया गया है, इसलिए शारीरिक गतिविधि और एक अच्छी तरह से संतुलित आहार के साथ रोकथाम महत्वपूर्ण है1,2। डेयरी प्रोटीन और आवश्यक अमीनो एसिड से समृद्ध विशेष रूप से तैयार किए गए खाद्य पदार्थों के साथ पोषण संबंधी हस्तक्षेपों ने सरकोपेनिया 2 को रोकने में सकारात्मक परिणाम दिखाए हैं। अन्य अध्ययनों में, लेखकों ने विटामिन और एंटीऑक्सिडेंट, जैसे विटामिन ई और आइसोफ्लेवोन्स को आहार में शामिल किया है, जिससे कमर और कूल्हों पर मांसपेशियों के लाभ के लिए लाभ बढ़ जाता है।
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) एक पेड़ है जो मैक्सिकन उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में बढ़ता है; यह अपने उच्च पोषण मूल्य के कारण माया संस्कृतियों द्वारा उपभोग किया गया है4. यह प्रोटीन, फाइबर, खनिज, और फेनोलिक एंटीऑक्सिडेंट का एक अच्छा स्रोत है, जैसे कि क्लोरोजेनिक एसिड 5। चूंकि इसे पाउडर में जमीन पर रखा जा सकता है और बेकिंग उत्पादों में उपयोग किया जा सकता है या पेय पदार्थों में खाया जा सकता है, हाल के अध्ययनों ने अपने पोषण मूल्य में सुधार करने के लिए विभिन्न खाद्य पदार्थों में रेमन बीज आटा (आरएसएफ) को शामिल करने का मूल्यांकन किया है। एक आरएसएफ-पूरक कैपुचिनो-स्वाद वाले पेय को तैयार किया गया था, जो आहार फाइबर में उच्च था और प्रति सेवारत 6 ग्राम से अधिक प्रोटीन था, और उपभोक्ताओं द्वारा अत्यधिक स्वीकार किया गया था; इस प्रकार, इसे विशेष आहार आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एक संभावित विकल्प माना जाता था6। एक अनुवर्ती अध्ययन में, आरएसएफ का उपयोग एक मफिन और प्रोटीन, आहार फाइबर, माइक्रोन्यूट्रिएंट्स और फेनोलिक एंटीऑक्सिडेंट में समृद्ध एक नए पेय को तैयार करने के लिए भी किया गया था। मफिन और पेय का उपयोग बुजुर्ग व्यक्तियों के लिए आहार हस्तक्षेप में किया गया था, जिन्होंने 30 दिनों के लिए प्रति दिन दो बार दोनों उत्पादों का सेवन किया था। इस अवधि के बाद, प्रतिभागियों की पोषण और सार्कोपेनिक स्थिति में सुधार हुआ, और प्लाज्मा की कुल फेनोलिक सामग्री में वृद्धि हुई। हालांकि, प्लाज्मा में कुल फेनोलिक यौगिकों का निर्धारण एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधि द्वारा किया गया था, इसलिए अवशोषित किए गए वास्तविक फेनोलिक यौगिकों की पहचान संभव नहीं थी; इसके अलावा, यह विधि फेनोलिक यौगिकों के लिए पूरी तरह से विशिष्ट नहीं है, इसलिए कुछ अतिरेक हो सकता है8।
इन एंटीऑक्सिडेंट में समृद्ध खाद्य पदार्थों की खपत के बाद अवशोषित होने वाले फेनोलिक यौगिकों की पहचान और परिमाणीकरण एक कठिन कार्य है, लेकिन इन फाइटोकेमिकल्स की जैविक गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक है। अधिकांश फेनोलिक यौगिकों की जैव उपलब्धता कम है; उनमें से 5% से कम प्लाज्मा में संरचनात्मक परिवर्तन के बिना पाया जा सकता है। फेनोलिक यौगिक कई बायोट्रांसफॉर्मेशन से गुजरते हैं, जैसे कि मिथाइलेशन, सल्फोनेशन, या ग्लूकोरोनिडेशन, जो एंटरोसाइट्स और हेपेटोसाइट्स 9 द्वारा किए जाते हैं। फेनोलिक यौगिकों को माइक्रोबायोटा द्वारा बैक्टीरियल कैटाबोलाइट्स में भी बायोट्रांसफॉर्म किया जाता है जो प्लाज्मा 10 में अवशोषित होने के बाद शरीर में अपने लाभकारी प्रभाव डाल सकते हैं। उदाहरण के लिए, फेनिलएसिटिक एसिड फ्लेवोनोइड्स और ओलिगोमेरिक प्रोएंथोसायनिडिन के जीवाणु परिवर्तन का एक उत्पाद है, जो क्रैनबेरी खपत के बाद मूत्र पथ में बैक्टीरिया (एस्चेरिचिया कोलाई) आसंजन के 40% तक को रोक सकता है।
स्वाभाविक रूप से होने वाले फेनोलिक यौगिकों की संरचनात्मक विविधता, उनके चयापचयों की विविधता और उनकी कम जैव उपलब्धता में जोड़ा गया है, प्लाज्मा में उनकी पहचान को और भी अधिक चुनौतीपूर्ण बनाता है। मेटाबोलोमिक प्रोफाइलिंग, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और अग्रानुक्रम द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी (एमएस / एमएस) जैसे स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषण प्लेटफार्मों का उपयोग करके, शायद इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा दृष्टिकोण है; दुर्भाग्य से, उपकरण आसानी से सुलभ नहीं है, और विश्लेषण प्रोटोकॉल का विकास अभी भी सीमित है12। कई अध्ययनों ने मेटाबोलोमिक अध्ययनों में द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की जटिलता को कम करने के लिए एक रणनीति के रूप में एक पृथक्करण प्रणाली (जैसे तरल क्रोमैटोग्राफी) के साथ एमएस / एमएस की सूचना दी है। अल्ट्रा-उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (यूपीएलसी) पृथक्करण विधियों की हालिया शुरुआत ने विश्लेषण के समय को कम कर दिया है और पारंपरिक उच्च-प्रदर्शन तरल प्रोटोकॉल की तुलना में संकल्प और संवेदनशीलता में वृद्धि की है, इसलिए यूपीएलसी-एमएस / एमएस सिस्टम को विश्लेषणात्मक मेटाबोलोमिक्स समुदाय 13 द्वारा तेजी से व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है। इस तरह, कुछ अध्ययनों ने फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की जांच की है और कैफेइक एसिड, क्वेरसेटिन और फेरुलिक एसिड से ग्लूकोरोनिडेट डेरिवेटिव का पता लगाया है, साथ ही क्रैनबेरी इनटेक 14 के बाद व्यक्तियों के प्लाज्मा में सिरिंगिक और वैनिलिक एसिड से सल्फोनेटेड डेरिवेटिव भी पाए गए हैं। पिछले प्रोटोकॉल ने प्लाज्मा जैसे बायोफ्लुइड्स में फेनोलिक यौगिकों और फेनोलिक मेटाबोलाइट्स को खोजने का इरादा किया है। ये प्रोटोकॉल उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा यूवी-विज़ डिटेक्टर 15 के साथ मिलकर पहचान और परिमाणीकरण पर आधारित थे। फिर भी, इस तरह के प्रोटोकॉल को पूर्ण पहचान और सटीक परिमाणीकरण का आकलन करने के लिए प्रामाणिक मानकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला ने यूपीएलसी-एमएस और यूपीएलसी-एमएस / एमएस द्वारा बायोफ्लुइड्स (सल्फोनेटेड, ग्लूकोरोनिडेट और मेथिलेटेड रूपों) में सबसे आम चयापचयों की पहचान की है; हालांकि, बैक्टीरियल मेटाबोलाइट्स का एक बड़ा हिस्सा डेटाबेस की कमी के कारण रिपोर्ट नहीं किया गया है जिसमें उनकी पूरी जानकारी होती है16। मेटाबोलाइट पहचान मेटाबोलाइट मानकों की लागत और वाणिज्यिक उपलब्धता से जटिल है। इसलिए, सबसे अच्छी रणनीति अनलक्षित या अर्ध-लक्षित एमएस / एमएस मेटाबोलाइट विश्लेषण हो सकती है, जो रासायनिक पहचान को निर्धारित करने के लिए आणविक विशेषता जानकारी (एम / जेड, मोनोआइसोटोपिक सटीक द्रव्यमान, आइसोटोपिक वितरण और विखंडन पैटर्न) के उपयोग पर निर्भर करती है और इसकी तुलना स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन डेटाबेस के साथ करती है जिसमें पॉलीपोलीफेनोल-रिचट्स 12 की खपत के बाद बायोफ्लुइड्स में पहचाने जाने वाले पॉलीफेनोल मेटाबोलाइट्स होते हैं। . फेनोलिक यौगिकों और उनके मेटाबोलाइट्स की पहचान के लिए यूपीएलसी-एमएस / एमएस अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले सबसे महत्वपूर्ण डेटाबेस मानव मेटाबोलोम डेटाबेस (एचएमडीबी), लिपिडब्लास्ट लाइब्रेरी, एमईटीलिन लाइब्रेरी और अन्य पूरक डेटाबेस हैं, जैसे कि PubChem, ChemSpider, और फिनोल एक्सप्लोरर 17।
वर्तमान अध्ययन में, आरएसएफ युक्त मफिन और पेय खपत अध्ययन में शामिल बुजुर्ग व्यक्तियों के समूह के प्लाज्मा नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक अर्ध-लक्षित यूपीएलसी-एमएस / एमएस विधि विकसित की गई थी। प्लाज्मा मेटाबोलाइट्स के विभिन्न मुफ्त ऑनलाइन डेटाबेस से डेटा एकत्र किया गया था और एक विशेष डेटाबेस में एकीकृत किया गया था। इस डेटाबेस को उपकरण सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से एक्सेस किया जा सकता है ताकि 30-दिवसीय पोषण हस्तक्षेप से पहले और बाद में पांच प्लाज्मा नमूनों में पॉलीफेनोलिक मेटाबोलाइट्स की पहचान की जा सके। यह मुख्य फेनोलिक यौगिकों, या उनके चयापचयों की पहचान करने के लिए किया जाता है, जो सरकोपेनिया की रोकथाम के लिए डिज़ाइन किए गए विशेष रूप से तैयार किए गए कार्यात्मक खाद्य पदार्थों से अवशोषित होते हैं।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्लाज्मा के नमूनों को सभी नैतिक दिशानिर्देशों का पालन करते हुए पिछले अध्ययन में एकत्र किया गया था और Universidad Autónoma de Ciudad Juárez से संस्थागत नैतिकता और बायोएथिक्स समिति (CIEB-2018-1-37) द्वारा अनुमोदित किया गया था। UPLC-MS/MS द्वारा प्लाज्मा में फेनोलिक यौगिकों और मेटाबोलाइट्स के निष्कर्षण और पहचान के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल को चित्र 1 में दर्शाया गया है।
चित्रा 1: अर्ध-लक्षित यूपीएलसी-एमएस / एमएस विधि द्वारा प्लाज्मा में फेनोलिक यौगिकों और चयापचयों के निष्कर्षण और पहचान का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
1. नमूना तैयारी
- विश्लेषण तक प्लाज्मा के नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
- 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लाज्मा के नमूनों को डीफ्रॉस्ट करें।
नोट: नमूनों को प्रक्रिया (5 मिनट) में तेजी लाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखा जा सकता है। - एक 2 mL माइक्रोट्यूब में प्लाज्मा नमूना के 200 μL जगह और शुद्ध इथेनॉल के 1,000 μL के साथ मिश्रण. भंवर 30 s के लिए प्लाज्मा नमूना.
नोट: प्लाज्मा नमूनों के साथ काम करते समय हमेशा दस्ताने का उपयोग करें। - 5 मिनट के लिए 6,580 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। centrifugation के बाद, एक micropipette या पाश्चर पिपेट के साथ supernatant इकट्ठा और यह एक नए microtube में जगह है. Supernatant को 4 °C पर स्टोर करें।
- पिछले चरण से छर्रे को 100% इथेनॉल के 1,000 μL, 30 s के लिए भंवर, और फिर 5 मिनट के लिए 6,580 x g पर सेंट्रीफ्यूज के साथ मिलाएं।
नोट: गोली दृढ़ता से पैक किया गया है और नमूना और शुद्ध इथेनॉल के बीच संपर्क सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से पुन: निलंबित करने की आवश्यकता है। इथेनॉल के साथ गोली फ्लश करने के लिए एक माइक्रोपिपेट के उपयोग की सिफारिश की जाती है। - centrifugation के बाद, supernatant इकट्ठा और supernatant पहले चरण 1.4 से प्राप्त supernatant के साथ मिश्रण. एक 2 mL microtube में.
- 135 साई पर शुद्ध नाइट्रोजन (99.997%) का उपयोग करके नमूने से इथेनॉल निकालें। नमूना हानि को रोकने के लिए सुई को माइक्रोट्यूब के शीर्ष से 1 सेमी दूर रखें और नमूना सूखने तक फ्लश करें। इथेनॉल को वाष्पित करने के लिए किसी भी गर्मी की आवश्यकता नहीं है।
नोट: नाइट्रोजन प्रवाह नमूना हानि को रोकने के लिए कम होना चाहिए। एक बार इथेनॉल सूख जाने के बाद, नमूना सूखापन सुनिश्चित करने के लिए नाइट्रोजन प्रवाह को कम से कम 5 मिनट के लिए रखें। प्रोटोकॉल को इस बिंदु पर रोका जा सकता है; नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। 12 घंटे से अधिक के लिए नमूनों को संग्रहीत करने से बचें। - एसिटोनिट्राइल के मिश्रण के 100 μL में सूखे नमूनों को फिर से निलंबित करें: 50: 50 (v: v) के अनुपात में पानी।
- एक 0.45 μm नायलॉन सिरिंज झिल्ली के माध्यम से सीधे एक HPLC शीशी माइक्रो डालने में नमूना फ़िल्टर करें.
नोट: शीशी में नमूनों को विश्लेषण से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। 8 घंटे से अधिक के लिए नमूनों को संग्रहीत करें। निस्पंदन के ठीक बाद यूपीएलसी प्रणाली में नमूनों को इंजेक्ट करने की सिफारिश की जाती है।
2. UPLC-MS/
- एक C18 रिवर्स-फेज कॉलम (50 मिमी x 2.1 मिमी; 1.8 μm) से सुसज्जित यूपीएलसी पर नमूने के 3 μL इंजेक्ट करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर autosampler तापमान और 25 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ थर्मोस्टेट सेट करें। प्रत्येक नमूने को तीन प्रतियों में इंजेक्ट करें।
- विलायक A के रूप में पानी में 0.1% (v:v) फॉर्मिक एसिड का उपयोग करें, और विलायक B के रूप में 100% एसिटोनिट्राइल का उपयोग करें। प्रवाह दर को 0.4 mL/min पर सेट करें और एक ग्रेडिएंट प्रोग्राम निम्नानुसार है: 0-1 मिनट 10% B, 1-4 मिनट 30% B, 4-6 मिनट 38% B, 6-8 मिनट 60% B, 8-8.5 मिनट 60% B, 8.5-9 मिनट B (तालिका 10)
- द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को नकारात्मक मोड आयनीकरण पर सेट करें। नाइट्रोजन का उपयोग 340 डिग्री सेल्सियस पर सुखाने वाली गैस के रूप में करें और 13 एल / मिनट की प्रवाह दर। 60 साई पर नेबुलाइज़र दबाव सेट करें। केशिका वोल्टेज को 4,000 वोल्ट पर सेट करें, 175 वोल्ट पर फ्रैग्मेंटर वोल्टेज, और 65 वोल्ट पर स्किमर वोल्टेज 20 वोल्ट (तालिका 2) पर टक्कर ऊर्जा का उपयोग करें।
- अनुपात (m/z) को चार्ज करने के लिए 100-1100 द्रव्यमान के बीच द्रव्यमान को स्कैन करें और, MS/MS के लिए, 50-1000 m/z (तालिका 2) के बीच द्रव्यमान को स्कैन करें। डेटा अधिग्रहण को ऑटो MS/MS मोड पर सेट करें. निम्न संदर्भ द्रव्यमान का उपयोग करें: 119.036 और 966.0007.
| समय (मिनट) | विलायक ए (एचपीएलसी पानी में 0.1% फॉर्मिक एसिड) | विलायक बी (100% एसिटोनिट्रिल) |
| 0 से 1 | 90 | 10 |
| 1 से 4 | 70 | 30 |
| 4 से 6 | 62 | 38 |
| 6 से 8 | 40 | 60 |
| 8 से 8.5 | 40 | 60 |
| 8.5 से 9 | 90 | 10 |
तालिका 1: मोबाइल चरण ढाल यूपीएलसी द्वारा फेनोलिक यौगिकों के पृथक्करण के लिए उपयोग किया जाता है।
| आयनीकरण मोड | नेगटिव |
| सुखाने वाली गैस | 340 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन, प्रवाह दर 13 एल / मिनट |
| नेबुलाइज़र दाब | 60 साई |
| केशिका वोल्टता | 175 वोल्ट |
| एमएस स्कैन द्रव्यमान | 100-1100 m/z |
| MS/MS स्कैन द्रव्यमान | 50-1000 m/z |
तालिका 2: MS/MS विश्लेषण के लिए Ionization पैरामीटर।
3. डेटाबेस निर्माण
- फेनोलिक यौगिकों, फेनोलिक मेटाबोलाइट्स, या वैज्ञानिक साहित्य में रुचि के अन्य यौगिकों की खोज करें।
- UPLC सिस्टम में शामिल डेटाबेस प्रबंधन सॉफ़्टवेयर खोलें। फ़ाइल | का चयन करें नई व्यक्तिगत डेटाबेस कंपाउंड लाइब्रेरी (PCDL) | नया PCDL बनाएँ. PCDL के प्रकार का चयन करें: LC/ PCDL के लिए कोई नाम सेट करें. फिर बनाएँ का चयन करें।
- उपकरण पट्टी में, PCDL का चयन करें और उसके बाद संपादन की अनुमति दें विकल्प। फिर यौगिकों को ढूँढें बटन पर क्लिक करें।
नोट:: चूंकि यह एक नया PCDL है, तालिका परिणाम खाली हो जाएगा। एक बार पीसीडीएल में नए यौगिकों को जोड़ने के बाद यह बदल जाएगा।- उपकरण के सामान्य पुस्तकालय से उन्हें कॉपी करके विशेष व्यक्तिगत डेटाबेस यौगिक पुस्तकालय में यौगिकों को जोड़ें। डेटाबेस प्रबंधन सॉफ़्टवेयर में शामिल उपकरण के मौजूदा डेटाबेस को खोलें. यौगिक ढूँढें बटन पर क्लिक करें. एकल खोज विकल्प में, ब्याज का यौगिक ढूँढने के लिए चक्रवृद्धि खोज मापदंड दर्ज करें.
नोट: यौगिकों को नाम, आणविक सूत्र, सटीक द्रव्यमान और प्रतिधारण समय से पाया जा सकता है। - चक्रवृद्धि परिणाम तालिका में, ब्याज के चक्रवृद्धि का चयन करें। एक से अधिक यौगिकों का चयन करने के लिए, पहले यौगिक पर क्लिक करें, CTRL कुंजी दबाए रखें, और तब ब्याज के प्रत्येक चक्र को क्लिक करें. फिर, सभी हाइलाइट किए गए यौगिकों पर राइट-क्लिक करें और PCDL में जोड़ें का चयन करें।
- नई विंडो में, खोज और विशेष व्यक्तिगत डेटाबेस फ़ाइल का चयन करें। बक्से को चिह्नित करें यदि मौजूद है तो यौगिकों के लिए स्पेक्ट्रा शामिल करें और यदि मौजूद हो तो यौगिकों के लिए आयन गतिशीलता जानकारी शामिल करें। जोड़ें बटन क्लिक करें. नए संवाद बॉक्स में, जोड़े गए नए यौगिकों की जाँच करने के लिए हाँ का चयन करें. रुचि के अधिक यौगिकों की खोज जारी रखने के लिए नहीं का चयन करें।
- उपकरण के सामान्य पुस्तकालय से उन्हें कॉपी करके विशेष व्यक्तिगत डेटाबेस यौगिक पुस्तकालय में यौगिकों को जोड़ें। डेटाबेस प्रबंधन सॉफ़्टवेयर में शामिल उपकरण के मौजूदा डेटाबेस को खोलें. यौगिक ढूँढें बटन पर क्लिक करें. एकल खोज विकल्प में, ब्याज का यौगिक ढूँढने के लिए चक्रवृद्धि खोज मापदंड दर्ज करें.
- यदि उपकरण के सामान्य पुस्तकालय में ब्याज के यौगिक उपलब्ध नहीं हैं, तो मैन्युअल रूप से नए यौगिकों को जोड़ें।
- विशेष व्यक्तिगत डेटाबेस खोलें। एक बार खोलने के बाद, चरण 3.3 का पालन करें। यौगिकों को संपादित करें विकल्प का चयन करें। नया जोड़ें बटन क्लिक करें.
- विंडो के ऊपरी भाग में, नए यौगिक के लिए जानकारी पूरी करें। सूत्र, नाम, IUPAC नाम, CAS संख्या, Chemspider ID, और अन्य पहचानकर्ता भरें.
- ब्याज के नए यौगिक के लिए जानकारी भरने के लिए मुफ्त ऑनलाइन पुस्तकालयों (Chemspider, PubChem, और Phenol Explorer) में उपलब्ध जानकारी का उपयोग करें। एक बार समाप्त होने के बाद, विशेष व्यक्तिगत डेटाबेस में नई यौगिक जानकारी को सहेजने के लिए नए के रूप में सहेजें बटन पर क्लिक करें।
नोट:: मुक्त पुस्तकालयों से जानकारी जोड़ते समय, क्लोराइड या आयोडाइड आयनों की उपस्थिति के बिना यौगिक जानकारी को शामिल करना सुनिश्चित करें। यह ब्याज के यौगिक के सटीक द्रव्यमान और आणविक सूत्र को संशोधित कर सकता है।
- विशेष व्यक्तिगत डेटाबेस को पूरा करने के लिए ब्याज के सभी यौगिकों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।
4. डेटा विश्लेषण
- नमूनों में मौजूद फेनोलिक यौगिकों और फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए उपकरण के गुणात्मक प्रबंधक सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
- नमूना फ़ाइल खोलें। क्रोमैटोग्राम पैनल में, क्रोमैटोग्राम परिभाषित करें का चयन करें और कुल आयन क्रोमैटोग्राम (TIC), MS (EIC) के निकाले गए आयन-क्रोमैटोग्राम और MS/MS के EIC को निकालें। एकीकृत क्रोमैटोग्राम विकल्प का चयन करें।
- यौगिक ढूँढें पैनल में, सूत्र-विकल्प द्वारा ढूँढें का चयन करें. नई विंडो में, सूत्र स्रोत और उसके बाद डेटाबेस/लायब्रेरी विकल्प का चयन करें। पहले से बनाए गए व्यक्तिगत डेटाबेस का पता लगाएं और ओपन पर क्लिक करें।
- सूत्र मिलान विकल्प का चयन करें और प्रति मिलियन (पीपीएम) 5 भागों की एक द्रव्यमान मिलान सहिष्णुता सेट करें।
नोट: जनता की एक अलग मैच सहिष्णुता 10 पीपीएम पर सेट किया जा सकता है; यह अंतर उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर निर्भर करता है। - नकारात्मक आयन विकल्प का चयन करें और केवल -H संवाद बॉक्स का चयन करें। परिणाम विकल्प में, निकालें EIC, निकालें साफ स्पेक्ट्रम, निकालें कच्चे स्पेक्ट्रम, और संरचना संवाद बक्से शामिल चिह्नित करें।
- परिणाम फ़िल्टर विकल्प का चयन करें। मार्क वार्न अगर स्कोर है और स्कोर मैच 80.00% पर सेट करें। मार्क मिलान नहीं है अगर स्कोर है और 75.00% पर स्कोर सेट करें।
नोट:: यदि आवश्यक हो तो मेल/नहीं मेल स्कोर को निम्न मानों में परिवर्तित किया जा सकता है. इससे पहचान की सटीकता कम हो जाएगी। - नमूने में रुचि के यौगिकों की पहचान करने के लिए सूत्र द्वारा यौगिकों को खोजें पर क्लिक करें।
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Representative Results
प्लाज्मा नमूनों के नकारात्मक मोड में अर्ध-लक्षित यूपीएलसी-एमएस /एमएस विश्लेषण के माध्यम से फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की पहचान के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रिया को चित्र 2 में दर्शाया गया है। सबसे पहले, प्लाज्मा phenolics निकालने से कुल आयन क्रोमैटोग्राम (TIC) (कुल प्लाज्मा नमूने के प्रोटीन वर्षा के बाद प्राप्त) उपकरण के गुणात्मक सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्राप्त किया गया था। फिर, निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम का उपयोग किया गया था, और प्रत्येक सिग्नल (या आणविक विशेषता) के सटीक द्रव्यमान और विखंडन पैटर्न (एमएस / एमएस विश्लेषण) की तुलना उपकरण के सॉफ़्टवेयर में भी बनाए गए एक विशिष्ट व्यक्तिगत डेटाबेस के साथ की गई थी। 5 पीपीएम से कम के द्रव्यमान मिलान वाले संकेतों को डेटाबेस से एक आणविक सूत्र सौंपा गया था। अंत में, प्रत्येक संकेत के आइसोटोपिक वितरण की तुलना अंतिम अस्थायी पहचान प्राप्त करने के लिए असाइन किए गए आणविक सूत्र से की गई थी। यौगिक जो ए) को केवल एक प्रतिकृति या बी में पहचाना गया था) 10,000 से कम क्षेत्र प्रस्तुत किया गया था, उन्हें झूठी पहचान के रूप में माना जाता था। इस विश्लेषण से, प्लाज्मा नमूनों में कुल 25 फेनोलिक यौगिकों और चयापचयों की पहचान की गई थी (तालिका 3)। इस सूची में, फेनोलिक यौगिकों और उनके मेटाबोलाइट्स, जैसे कि 3-हिड्रोक्सीफेनिलवैलेरिक एसिड और आइसोप्रोपिल 3-(3,4-डाइहाइड्रॉक्सीफेनिल) -2-हाइड्रॉक्सीप्रोपेनोएट, दोनों पाए गए। चूंकि नकारात्मक आयनीकरण मोड एंथोसायनिन को छोड़कर फेनोलिक यौगिकों के सभी वर्गों के लिए सबसे उपयुक्त है, इसलिए इन यौगिकों को वर्तमान विधि के साथ पता नहीं लगाया जा सकता है। यदि एंथोसायनिन खाद्य मैट्रिक्स के महत्वपूर्ण घटक हैं, तो सकारात्मक मोड का भी उपयोग किया जाना चाहिए।
| फेनोलिक मेटाबोलाइट्स | R.T. (min) | नियम | पूर्ववर्ती | प्रयोगात्मक द्रव्यमान | सैद्धांतिक द्रव्यमान | अंतर (पीपीएम) | |
| 2,3-Dihydroxybenzoic एसिड | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-Hydroxyhippuric एसिड | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroxytoluene | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-Hydroxyphenylvaleric एसिड | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihydroxyphenyl)-valeric एसिड | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| अजुगोल | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| बेंजोइक अम्ल | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| कार्नोसिक अम्ल | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| कार्नोसोल | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| कैटेकोला | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| ग्लाइसिटिन | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| हेस्पेरेटिन | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| हिप्यूरिक अम्ल | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| होमोवैनिलिक अम्ल | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| आइसोप्रोपिल 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| फेनिलऐसिटिक अम्ल | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| फ्लोरेटिक अम्ल | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| प्रोटोकैटेचुइक ऐल्डिहाइड | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| वनीलिन | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| एपिकैटेचिन 3'-ओ-ग्लूकुरोनाइड | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| गोमिसिन एम2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| आइरिसोलिडोन | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| यूरोलिथिन C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
तालिका 3: अर्ध-लक्षित यूपीएलसी-एमएस / एमएस विधि द्वारा प्लाज्मा नमूनों में फेनोलिक यौगिकों और चयापचयों की अस्थायी पहचान।
मुख्य फेनोलिक यौगिकों, या उनके चयापचयों की पहचान के लिए डिज़ाइन की गई विधि की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, जिन्हें आरएसएफ युक्त मफिन और पेय से अवशोषित किया गया था, अध्ययन प्रतिभागियों के पांच एलेटरी नमूने, 30-दिवसीय हस्तक्षेप से पहले और बाद में प्राप्त किए गए थे, का विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक यौगिक की सापेक्ष बहुतायत की गणना उपचार से पहले एयूसी द्वारा उपचार के बाद वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र को विभाजित करके की गई थी। इस विश्लेषण से, यह देखना संभव था कि कुछ यौगिक केवल उपचार से पहले प्राप्त नमूनों में दिखाई दिए, अन्य अपरिवर्तित रहे, जबकि उनमें से कुछ कार्यात्मक खाद्य पदार्थों की खपत के बाद बढ़ गए। तालिका 4 12 फेनोलिक यौगिकों की सूची दिखाती है जो आरएसएफ युक्त खाद्य पदार्थों की 30-दिन की खपत के बाद प्लाज्मा में वृद्धि दिखाते हैं। फेनिलएसिटिक एसिड उपचार के बाद उच्च सांद्रता में लगातार पाया जाने वाला एकमात्र मेटाबोलाइट था। ग्लाइसिटिन, एक ग्लाइकोसिलेटेड आइसोफ्लेवोन, और 3-हाइड्रॉक्सीफेनिलवैलेरिक एसिड (एक फेनोलिक मेटाबोलाइट) पांच नमूनों में से तीन में वृद्धि हुई लेकिन अन्य दो में कमी आई। गोमिसिन एम 2, एक लिग्नन, पोषण संबंधी हस्तक्षेप के बाद ही पांच नमूनों में से तीन में पाया गया था। अन्य फेनोलिक यौगिक (जैसे हेस्पेरेटिन, सेकोइसोलैरिसिनोल, और वैनिलिन) और मेटाबोलाइट्स (जैसे 2-हाइड्रॉक्सीहिप्पुरिक एसिड) केवल एक नमूने में पाए गए थे और केवल उपचार के बाद।
| नमूना (उपचार से पहले उपचार के बाद AUC / AUC) | |||||||
| यौगिक | नियम | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-Hydroxyhippuric एसिड | C18H33NO4 | T | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | |
| 3-Hydroxyphenylvaleric एसिड | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | C18H22O5 | मरोड़ना | मरोड़ना | T | मरोड़ना | मरोड़ना | |
| ग्लाइसिटिन | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| हेस्पेरेटिन | C16H14O6 | T | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | |
| फेनिलऐसिटिक अम्ल | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| फ्लोरेटिक अम्ल | C9H10O3 | T | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | |
| प्रोटोकैटेचुइक ऐल्डिहाइड | C7H6O3 | T | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | |
| वनीलिन | C8H8O3 | T | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | मरोड़ना | |
| गोमिसिन एम2 | C22H26O6 | मरोड़ना | T | T | T | मरोड़ना | |
तालिका 4: फेनोलिक यौगिकों की सूची जो आरएसएफ युक्त खाद्य पदार्थों की 30-दिन की खपत के बाद बुजुर्ग व्यक्तियों के प्लाज्मा में वृद्धि हुई है। डेटा उपचार से पहले उनकी बहुतायत की तुलना में उपचार के बाद प्रत्येक यौगिक की बहुतायत (एयूसी) के अनुपात हैं। टी इंगित करता है कि यौगिक को उपचार के बाद केवल नमूने में पहचाना गया था। एनडी: पता नहीं चला।
चित्र 2: अर्ध-लक्षित UPLC-MS/MS द्वारा फेनोलिक यौगिक मेटाबोलाइट्स की पहचान के लिए प्रोटोकॉल। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
खाद्य या खाद्य पूरक की खपत के बाद अवशोषित होने वाले बायोएक्टिव फाइटोकेमिकल्स की पहचान और परिमाणीकरण इन यौगिकों और उनसे युक्त खाद्य पदार्थों के स्वास्थ्य लाभों को प्रदर्शित करने और समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। वर्तमान कार्य में, यूपीएलसी-एमएस / एमएस विधि विकसित की गई थी, जिसका उद्देश्य केवल मुख्य फेनोलिक यौगिकों और उनके चयापचयों की पहचान करना था जो विशेष रूप से बुजुर्गों के लिए तैयार किए गए दो खाद्य उत्पादों के साथ 30-दिवसीय पोषण हस्तक्षेप के बाद प्लाज्मा में एकाग्रता में वृद्धि हुई थी। यह माना जाता था कि, यदि हस्तक्षेप अवधि के बाद ही प्लाज्मा में एक यौगिक में वृद्धि या दिखाई देता है, तो उस यौगिक को हस्तक्षेप में उपयोग किए जाने वाले खाद्य पदार्थों से अवशोषित और / या बायोट्रांसफॉर्म किया गया था।
यूपीएलसी-एमएस / एमएस मेटाबोलोमिक अध्ययनों के लिए पसंदीदा प्रौद्योगिकियों में से एक है जिसमें कुछ उपचार या पर्यावरणीय परिवर्तन के प्रभाव का आकलन करने के लिए जटिल नमूनों में कई कम आणविक वजन यौगिकों का एक साथ विश्लेषण किया जाता है। यह लक्षित और गैर-लक्षित (या वैश्विक) विधियों के माध्यम से किया जा सकता है। लक्षित विश्लेषण ब्याज के मेटाबोलाइट्स की एक ज्ञात, छोटी संख्या पर ध्यान केंद्रित करते हैं। वे उपलब्ध मानकों के साथ यौगिकों को परिमाणित करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हैं, जो सर्वोत्तम विशिष्टता और संवेदनशीलता प्रदान करते हैं; हालांकि, इन विधियों को चयनित मेटाबोलाइट्स के लिए पूरी तरह से अनुकूलित किया जाना चाहिए और नमूने 12 में अप्रत्याशित यौगिकों का पता लगाने में असमर्थ हैं। अन्य अध्ययनों में, एचपीएलसी का उपयोग यूवी-विज़ डिटेक्टर के साथ मिलकर प्लाज्मा में फेनोलिक एसिड और मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए किया गया है, लेकिन इस प्रकार के अध्ययन ने ब्याज 15 के यौगिक की पहचान करने और मापने के लिए विश्लेषणात्मक मानकों का उपयोग किया है। एक अन्य अध्ययन में, एक आंतरिक मानक के अतिरिक्त प्रस्तावित किया गया था18; हालांकि, इस काम में केवल फेरुलिक और कैफेइक एसिड और उनके मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण किया गया था। दूसरी ओर, फेनोलिक मेटाबोलाइट्स के आंतरिक मानकों के संश्लेषण को वाणिज्यिक विश्लेषणात्मक मानकों की कमी के विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है। फिर भी, फेनोलिक यौगिकों की एक बड़ी विविधता का संश्लेषण मुश्किल, समय लेने वाला और महंगा है। गैर-लक्षित तरीके यथासंभव कई आणविक यौगिकों का पता लगाने और पहचानने का प्रयास करते हैं और मुख्य रूप से परिकल्पना-उत्पन्न करने वाले 12 हैं। वे विशेषता विशेषताओं के साथ पता लगाने योग्य क्रोमैटोग्राफिक संकेतों को सूत्रों को असाइन करके एक नमूने में कई सैकड़ों यौगिकों की पहचान कर सकते हैं, जैसे कि एम / जेड या मापा गया सटीक द्रव्यमान, क्रोमैटोग्राफिक प्रतिधारण समय, आइसोटोपिक फिंगरप्रिंट, आदि, इसलिए इन विश्लेषणों द्वारा उत्पन्न डेटा बहुत प्रचुर मात्रा में हैं और व्याख्या करना मुश्किल हो सकता है20 . चूंकि वर्तमान विधि का उद्देश्य प्लाज्मा नमूनों का एक पूर्ण चयापचय प्रोफ़ाइल प्राप्त करना नहीं था (जो एक अप्राप्य दृष्टिकोण होगा) लेकिन उनमें प्रमुख फेनोलिक यौगिकों और फेनोलिक मेटाबोलाइट्स (पहले अज्ञात) की पहचान करने के लिए, एक अर्ध-लक्षित दृष्टिकोण तैयार किया गया था। इसके लिए, सभी पहचाने गए संकेतों को उपकरण के सॉफ़्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से निकाला गया था और फिर एक स्व-निर्मित डेटाबेस के साथ तुलना की गई थी जिसमें 645 फेनोलिक यौगिक और उनके मेटाबोलाइट्स शामिल थे, जो मुफ्त ऑनलाइन डेटाबेस से प्राप्त किए गए थे। डेटाबेस में यौगिकों के संदर्भ एमएस / एमएस विखंडन पैटर्न शामिल थे जिनका उपयोग यौगिक नाम और सूत्र के असाइनमेंट के लिए किया गया था, जो नमूना 12 में यौगिकों की अधिक सटीक पहचान के लिए अनुमति देता है।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम 1) नमूना pretreatment (निष्कर्षण और प्लाज्मा के नमूनों से phenolic यौगिकों और चयापचयों की एकाग्रता) थे; 2) नमूनों के अर्ध-लक्षित विश्लेषण के लिए एक पूर्ण और विशिष्ट डेटाबेस का निर्माण और एक विशिष्ट यौगिक वर्ग से संबंधित सभी संभावित यौगिकों की पहचान; और 3) उपकरण के गुणात्मक सॉफ़्टवेयर द्वारा उपयोग किए जाने वाले मापदंडों का चयन (बड़े पैमाने पर मिलान सहिष्णुता पीपीएम, और स्कोर%) नमूने में यौगिकों की सटीक पहचान करने के लिए। नमूना pretreatment में, सावधानी के लिए ब्याज के यौगिकों के नुकसान से बचने के लिए लिया जाना चाहिए, उन्हें एक उच्च अंतिम एकाग्रता पर ठीक है, और हस्तक्षेप यौगिकों को खत्म करने में सक्षम हो. विशिष्ट डेटाबेस के निर्माण में, एक पूरी तरह से साहित्य खोज का संचालन करना और फिर विशिष्ट रासायनिक डेटा प्राप्त करने के लिए मुफ्त ऑनलाइन डेटाबेस का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिसका उपयोग नमूने में यौगिक पहचान के लिए किया जाएगा। बड़े पैमाने पर मिलान और स्कोर के लिए सबसे अच्छा मूल्यों के चयन मानकों और ज्ञात नमूनों 21,22 का उपयोग करके विश्लेषणात्मक विधि के पिछले सत्यापन की आवश्यकता है।
एक बार प्रोटोकॉल लागू होने के बाद, सामान्य समस्याएं और उनके अनुशंसित समाधान निम्नलिखित थे: 1) नमूनों में कोई यौगिकों की पहचान नहीं की गई थी। यह यौगिकों की कम सांद्रता के कारण था और नमूने को सुखाकर और इसे एक छोटी मात्रा में फिर से भंग करके हल किया जा सकता था। 2) टीआईसी में सिग्नल दिखाई दिए, लेकिन यौगिकों की पहचान नहीं की गई। यह बड़े पैमाने पर अंशांकन में विफलता के कारण हो सकता है, इसलिए प्रयोगात्मक और सैद्धांतिक द्रव्यमान के बीच का अंतर अधिक था। इस मामले में, उपकरण के बड़े पैमाने पर अंशांकन निर्माता और उपकरण के मॉडल के अनुसार किया जाना चाहिए। एक दूसरा कारण एक अधूरा व्यक्तिगत डेटाबेस हो सकता है, इसलिए डेटाबेस को लगातार जांचना और बनाए रखना महत्वपूर्ण है। ब्याज के होने का संदेह करने वाले यौगिकों के द्रव्यमान की जांच की जा सकती है और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन डेटाबेस या नए वैज्ञानिक साहित्य के साथ तुलना की जा सकती है। 3) सिग्नल खाली रन में दिखाई दिए। यह संदूषण को इंगित करता है और ऑटोसैम्पलर सुई और कॉलम की सफाई करके हल किया जा सकता है। मानक सफाई प्रोटोकॉल मेथनॉल का उपयोग करके कुछ रन करना है, फिर आइसोप्रोपेनोल, और अंत में मोबाइल चरण के रूप में एसिटोनिट्राइल। फिर कॉलम को फिर से संतुलित किया जाता है, कम से कम 30 मिनट के लिए मोबाइल चरण चलाया जाता है।
इस तरह की विधि के विकास में प्रमुख कठिनाइयां हैं 1) कम जैव उपलब्धता, सामान्य शब्दों में, फेनोलिक यौगिकों सहित सभी फाइटोकेमिकल्स की, जो बहुत कम प्लाज्मा सांद्रता का अनुवाद करती है16; 2) खाद्य पदार्थों में मौजूद फेनोलिक यौगिकों की उच्च विविधता, जो उनके चयापचय और बायोट्रांसफॉर्मेशन द्वारा बढ़ जाती है जो मानव एंटरोसाइट्स और हेपेटोसाइट्स और कोलोनिक माइक्रोबायोटा 23 में होती है; 3) मानकों की कमी (कुछ मानक मौजूद हैं लेकिन प्राप्त करना बहुत मुश्किल है) कई यौगिकों के लिए, विशेष रूप से चयापचयों के लिए, और कुछ अज्ञात या अस्वाभावित यौगिकों के अस्तित्व के लिए 23; और 4) व्यक्तियों के बीच चर प्रतिक्रियाएं, दोनों अवशोषण और phytochemicals14 के चयापचय में। फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की कम प्लाज्मा सांद्रता की समस्या को दूर करने के लिए, उन्हें निकाला और केंद्रित किया जाना चाहिए। यह सूक्ष्म ठोस-चरण निष्कर्षण 14 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है या, जैसा कि वर्तमान काम में है, सॉल्वैंट्स के अलावा जो प्रोटीन को अवक्षेपित करते हैं और फेनोलिक यौगिकों और चयापचयों को भंग करते हैं, इसके बाद विलायक वाष्पीकरण और एक छोटी मात्रा में पुन: निलंबन 19 होता है। यह तकनीक सरल, आर्थिक और नमूनों की एक छोटी संख्या के लिए पर्याप्त है। हालांकि, ब्याज के यौगिकों की वसूली को बड़े प्लाज्मा वॉल्यूम का उपयोग करके आसानी से सुधारा जा सकता है, इसलिए सभी यौगिकों की अंतिम एकाग्रता अधिक होगी। फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की उच्च विविधता और मानकों की कमी का कारण यह है कि उन्हें मापने का प्रयास करने से पहले हस्तक्षेप द्वारा बढ़ाए गए यौगिकों की पहचान करने के लिए एक अर्ध लक्षित दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। पूरी तरह से untargeted विश्लेषण के बजाय एक विशेष रूप से बनाए गए डेटाबेस का उपयोग करके, प्लाज्मा में कई प्राथमिक चयापचयों को अनदेखा करना संभव था, केवल फेनोलिक यौगिकों और उनके चयापचयों पर ध्यान केंद्रित करना। इस डेटाबेस की एक महत्वपूर्ण सीमा, फेनोलिक यौगिकों और उनके मानव चयापचयों के लिए विशिष्ट, कई यौगिकों और उनके चयापचयों के लिए बड़े पैमाने पर वर्णक्रमीय जानकारी की कमी थी, जो यौगिक पहचान की सटीकता को कम करती है।
व्यक्तियों के बीच बड़ी परिवर्तनशीलता नियमित रूप से फेनोलिक यौगिकों के अवशोषण और चयापचय का मूल्यांकन करने वाले अध्ययनों में देखी जाती है, दोनों क्वांटिटिव और गुणात्मक रूप से। वर्तमान परिणामों में, एक व्यक्ति ने हस्तक्षेप के बाद लिए गए प्लाज्मा नमूने में 18 यौगिकों को प्रस्तुत किया, जबकि अन्य ने केवल 9 या 10 दिखाया। इसके अलावा, कई फेनोलिक यौगिकों और चयापचयों को केवल बेसलाइन नमूनों (हस्तक्षेप से पहले) में पाया गया था, और वे व्यक्तियों के बीच भी भिन्न थे। कुल मिलाकर, आधे से अधिक पहचाने गए यौगिकों ने हस्तक्षेप के बाद की तुलना में पहले उच्च सांद्रता (एयूसी) दिखाई या केवल पूर्व-हस्तक्षेप नमूनों में पाए गए। इसलिए, हस्तक्षेप से पहले और बाद में लिए गए व्यक्तिगत नमूनों की तुलना करना आवश्यक था ताकि यह समझा जा सके कि वास्तव में इसके द्वारा कौन से यौगिकों में वृद्धि हुई थी। उपचार के बाद लगातार बढ़ने वाला एकमात्र मेटाबोलाइट फेनिलएसिटिक एसिड था, जो फ्लेवन -3-ओएलएस 24 का एक माइक्रोबियल कैटाबोलाइट था जो फेनोलिक-समृद्ध खाद्य पदार्थों की खपत के तीव्र अध्ययन में व्यक्तियों के प्लाज्मा में पाया गया है14,25। प्लाज्मा में फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने वाले अधिकांश अध्ययन तीव्र अध्ययन थे, जिसमें फेनोलिक-समृद्ध भोजन की खपत के बाद 24 घंटे के दौरान यौगिक सांद्रता की निगरानी की गई थी, यह देखते हुए कि, 24 घंटे के बाद, उनकी सांद्रता बेसल मूल्य 19,25 के पास थी। इसलिए, यह समझ में आता है कि वर्तमान काम में विश्लेषण किए गए नमूनों ने फेनोलिक मेटाबोलाइट्स की कम संख्या और सांद्रता दिखाई। हाल ही में, झांग एट अल.25 ने लाल रास्पबेरी की खपत का मूल्यांकन किया, दोनों तीव्र अध्ययनों में और पूरकता के 4 सप्ताह के बाद। उन्होंने देखा कि तीव्र और पुरानी दोनों हस्तक्षेपों ने फेनोलिक यौगिकों और उनके चयापचयों में वृद्धि की, जबकि 4-सप्ताह के पूरक के बाद, कुछ चयापचयों की बेसल प्लाज्मा एकाग्रता में वृद्धि हुई (यूरोलिथिन, सिनैमिक, फेनिलप्रोपियोनिक, और हिप्पुरिक एसिड) और दूसरों में कमी आई (संयुग्मित एंथोसायनिन डेरिवेटिव)।
वर्तमान पेपर में विकसित विधि की अंतिम परीक्षा से पता चलता है कि, अधिकांश भागों में, यह उस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से अनुकूल था जिसके लिए इसे बनाया गया था। नमूना pretreatment सरल और प्रभावी था, और UPLC अलगाव और अर्ध लक्षित एमएस / यह अर्ध-लक्षित विधि फेनोलिक यौगिकों की पहचान करने के लिए पहले स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के रूप में उपयोगी हो सकती है जिसे विभिन्न खाद्य मैट्रिक्स से अवशोषित किया जा सकता है, साथ ही साथ मानव प्लाज्मा में मौजूद फेनोलिक मेटाबोलाइट्स भी। इसके अलावा, प्रोटोकॉल उपयोगी है क्योंकि यह पहचान की अनुमति देता है जब फेनोलिक यौगिकों या चयापचयों से कोई मानक उपलब्ध नहीं होते हैं। अंत में, विधि एक छोटी प्लाज्मा मात्रा का उपयोग करती है, जो विवो अध्ययनों में अधिकांश में महत्वपूर्ण है जहां प्लाज्मा नमूने दुर्लभ हैं। हालांकि, यह सिफारिश की जाती है कि, भविष्य के अध्ययनों के लिए, विशेष रूप से तैयार किए गए खाद्य पदार्थों से अवशोषित मुख्य फेनोलिक यौगिकों और चयापचयों की बेहतर पहचान करने के लिए पुरानी हस्तक्षेप से पहले एक तीव्र अध्ययन किया जाना चाहिए।
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Disclosures
सभी लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
लेखककॉनासाइट, मेक्सिको (सीबी- 2016-01-286449), और UACJ-PIVA (परियोजनाएं 313-17-16 और 335-18-13) से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं। OAMB अपनी पीएचडी छात्रवृत्ति के लिए CONACYT को धन्यवाद देना चाहता है। UACJ से मल्टीमीडिया उत्पादन कार्यालय से तकनीकी सहायता कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार की जाती है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
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