يتم تقديم طريقة للتشريح المجهري لقناة بيض الفأر تسمح بجمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف إجراء تفكك الخلايا البيضوية غير الأنزيمية. الطرق مناسبة لتحليل الجينات والبروتين اللاحق للقطاعات البيضية المختلفة وظيفيا والخلايا البيضوية المنفصلة.
أنظمة نماذج الفئران لا مثيل لها لتحليل عمليات المرض بسبب قابليتها للتلاعب الجيني وانخفاض تكلفة العلاجات التجريبية. ومع ذلك ، بسبب صغر حجم الجسم ، أثبتت بعض الهياكل ، مثل قناة البيض التي يبلغ قطرها 200-400 ميكرومتر ، أنه من الصعب نسبيا دراستها إلا عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. في الآونة الأخيرة ، كشفت الدراسات الكيميائية النسيجية المناعية عن اختلافات أكثر تعقيدا في قطاعات قناة البيض مما كان معترفا به سابقا. وبالتالي ، تنقسم قناة البيض إلى أربعة أجزاء وظيفية بنسب مختلفة من سبعة أنواع متميزة من الخلايا الظهارية. من المحتمل أن تجعل الأصول والنسب الجنينية المختلفة لأنواع الخلايا الظهارية المناطق الوظيفية الأربع عرضة للأمراض بشكل مختلف. فعلى سبيل المثال، تنشأ آفات السلائف للسرطان المصلي داخل الظهارة من الإنفونديبولوم في نماذج الفئران ومن المنطقة الفيمبرية المقابلة في قناة فالوب البشرية. يفصل البروتوكول الموصوف هنا طريقة للتشريح المجهري لتقسيم قناة البيض بطريقة تنتج كمية كافية ونقاء من الحمض النووي الريبي الضروري للتحليل النهائي مثل النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq). كما وصفت طريقة تفكك الأنسجة غير الأنزيمية في الغالب المناسبة لقياس التدفق الخلوي أو تحليل RNAseq أحادي الخلية للخلايا البيضية المتمايزة تماما. ستسهل الطرق الموصوفة إجراء مزيد من الأبحاث باستخدام قناة البيض الفئرانية في مجال التكاثر والخصوبة والسرطان والمناعة.
تتشابه قناة البيض الفئرانية في وظيفتها ومورفولوجيتها مع قناة فالوب البشرية1. يتكون كلاهما من ظهارة هدبية زائفة ، تتكون من خليتين مقيمتين ظهاريتين موصوفتين تاريخيا: الخلايا الهدبية والخلايا الإفرازية1,2. تحتوي قناة البيض على ثلاثة أجزاء معترف بها كلاسيكيا: infundibulum و ampulla و isthmus. في دراسة حديثة ، Harwalkar et al. 3 بحث في مورفولوجيا قناة البيض والتعبير الجيني مما أدى إلى توسيع تصنيف الخلايا الظهارية المقيمة إلى سبع مجموعات سكانية متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأوا تقاطع البرزخ الأمبولاري كجزء متميز من قناة البيض3. يمكن بسهولة توسيع الطريقة الموصوفة هنا ، والتي تركز على infundibulum و ampulla و برزخ ، لتشمل التقاطع الأمبولاري البرزخي أيضا2,3. تحتوي المنطقة القاعية على ostium ، أو فتحة قناة البيض ، وتشمل المنطقة fimbrial وكذلك الساق القريبة. بالانتقال نحو الرحم ، التالي هو الأمبولا ، ثم البرزخ. الخلايا الهدهدية هي الأكثر بروزا في الطرف البعيد من المنطقة ، بالقرب من المبيض ، أو infundibulum ، في حين أن الخلايا الإفرازية هي الأكثر بروزا في الطرف القريب أو جزء البرزخ 1. على عكس قناة فالوب البشرية ، فإن قناة البيض الفئران هي بنية ملفوفة مدعومة من الميزوسالبينكس ، وهو امتداد للرباط العريض الصفاق 1,4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغليف قناة بيض الفأر في كيس جرابي يزيد من احتمال نقل البويضات إلى قناة البيض4. يتم تحديد الأمبولا على أنها موقع الإخصاب ، الذي تمر منه الأجنة النامية إلى البرزخ قبل دخول الرحم5. يبلغ قطر الأجزاء البوقية 200-400 ميكرومتر ويبلغ طول المناطق الأطول من الأمبولاري والبرزخ حوالي 0.5-1.0 سم4. تتوزع قناة البيض خلال دورة الاستروس والأمبولا و infundibulum أكثر قابلية للتمدد من البرزخ1.
إن الإفراط في انتشار الخلايا، وخاصة الخلايا الإفرازية، يميز آفات السلائف إلى الأورام المصلية الموجودة في تجويف الحوض6. تنشأ هذه الآفات المصلية داخل الظهارة السلائف في ظهارة قناة البيض فقط في المنطقة الفيمبرية. من غير المعروف لماذا يقتصر تكوين الآفة على هذه المنطقة حيث عادة ما يكون نوع الخلايا السائد مهدبا ، وليس إفرازيا2،7،8. تؤكد الإقليمية من حيث الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية ، وكذلك الاهتمام المتزايد بالأصل القضوي لسرطان المبيض 9،10،11،12،13 ، على أهمية التقييم المنفصل لقطاعات قناة البيض.
تفصل الطريقة الموصوفة هنا جمع شرائح قنوات البيض المنفصلة للتحليلات اللاحقة في المصب للتعبير الجيني الخاص بالشرائح ووظيفة الخلايا المنفصلة. تقليديا ، تتم معالجة العديد من الأنسجة لاستخراج الحمض النووي الريبي بالكامل باتباع إما الفينول: طريقة الكلوروفورم أو طريقة الاستخراج الكامل على العمود. ومع ذلك ، وجدنا أنه تم الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي مع إنتاج عائد كاف باستخدام طريقة الجمع الموصوفة. باستخدام هذه الطريقة، يمكن معالجة أجزاء وظيفية صغيرة جدا من قناة البيض للتحليلات النهائية بدلا من التحقيق في قناة البيض ككل، والتي يمكن أن تخفي النتائج التي تمثل القطاعات المختلفة14.
نادرا ما تم التحقيق في الخلايا المبيضية الفئرانية المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، على الأرجح بسبب الحد من إنتاجية الخلايا من هذا الأنسجة. كان أحد الأساليب للتغلب على هذه المشكلة هو فصل الخلايا ، وتنميتها في الثقافة ، ثم تحفيز إعادة التمايز في المختبر للحصول على أرقام الخلايا المناسبة لتحليل الخلايا في المراحل النهائية15،16،17،18. أحد القيود المفروضة على هذا النهج هو الوقت خارج الجسم الحي والبيئة الدقيقة المتغيرة في الثقافة ، وكلاهما من المحتمل أن يغير التعبير الجيني. هناك أيضا افتراض بأن إعادة التمايز المورفولوجي لها نفس التوقيع النسخي والبروتيني كما كان موجودا في الحيوان السليم. تم تصميم طريقة التفكك الحالية لتحقيق أكبر عدد من الخلايا الظهارية في مجموعة خلايا القنوات البيضاوية غير المتجانسة مع الحفاظ على تمايز الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يحد النهج غير الأنزيمي في الغالب من فقدان بروتينات سطح الخلية.
الأجزاء الثلاثة من قناة البيض متميزة نسيجيا ومورفولوجيا ووظيفيا1،2،3. تختلف الظهارة اختلافا كبيرا من أحد طرفي قناة البيض إلى الطرف الآخر. تهيمن الخلايا الهدبية في الطرف الوهمي/القاعي، بينما تهيمن الخلايا الإفرازية في المنطقة البرزخية1.<su…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جائزة وزارة الدفاع للاختراق إلى AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). تم دعم KCR جزئيا من خلال زمالات داخلية: زمالة Pease Cancer Pre-PhD وزمالة Mary Galvin Burden Pre-PhD في العلوم الطبية الحيوية وجامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، الجوائز الداخلية: منحة أبحاث أطروحة لجنة زمالة مجلس الدراسات العليا وجائزة برنامج سنة أطروحة قسم الدراسات العليا. يشكر المؤلفون جيليان م. رايت وأليسا م. كوماري على المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها في وقت مبكر لهذه الطريقة.
0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
25G needle | BD | 305122 | |
60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20C for dissection |
Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text. |
Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |