Mikrodissektion und Dissoziation des Murinen Eileiters: Identifizierung einzelner Segmente und Einzelzellisolierung

Summary

Eine Methode zur Mikrodissektion des Eileiters der Maus, die die Sammlung der einzelnen Segmente unter Beibehaltung der RNA-Integrität ermöglicht, wird vorgestellt. Darüber hinaus wird ein nicht-enzymatisches oviduktales Zelldissoziationsverfahren beschrieben. Die Methoden eignen sich für die anschließende Gen- und Proteinanalyse der funktionell unterschiedlichen Eileitersegmente und dissoziierten Eileiterzellen.

Abstract

Mausmodellsysteme sind aufgrund ihrer genetischen Manipulierbarkeit und der geringen Kosten experimenteller Behandlungen unübertroffen für die Analyse von Krankheitsprozessen. Aufgrund ihrer geringen Körpergröße haben sich jedoch einige Strukturen, wie der Eileiter mit einem Durchmesser von 200-400 μm, als relativ schwierig erwiesen, außer immunhistochemisch zu untersuchen. In jüngster Zeit haben immunhistochemische Studien komplexere Unterschiede in den Eileitersegmenten aufgedeckt als bisher angenommen; So wird der Eileiter in vier funktionelle Segmente mit unterschiedlichen Verhältnissen von sieben verschiedenen Epithelzelltypen unterteilt. Die unterschiedlichen embryologischen Ursprünge und Verhältnisse der epithelialen Zelltypen machen die vier funktionellen Regionen wahrscheinlich unterschiedlich anfällig für Krankheiten. Zum Beispiel entstehen Vorläuferläsionen zu serösen intraepithelialen Karzinomen aus dem Infundibulum in Mausmodellen und aus der entsprechenden Fimbrialregion im menschlichen Eileiter. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine Methode zur Mikrodissektion, um den Eileiter so zu unterteilen, dass eine ausreichende Menge und Reinheit der RNA entsteht, die für die nachgeschaltete Analyse wie die reverse transkriptionsquantitative PCR (RT-qPCR) und die RNA-Sequenzierung (RNAseq) erforderlich ist. Ebenfalls beschrieben ist eine meist nicht-enzymatische Gewebedissoziationsmethode, die für die Durchflusszytometrie oder die Einzelzell-RNAseq-Analyse von vollständig differenzierten Eileiterzellen geeignet ist. Die beschriebenen Methoden werden die weitere Forschung unter Verwendung des moinen Eileiters auf dem Gebiet der Fortpflanzung, Fruchtbarkeit, Krebs und Immunologie erleichtern.

Introduction

Der eiförmige Eileiter ähnelt in Funktion und Morphologie dem menschlichen ^Eileiter1. Beide bestehen aus einem pseudostratifizierten Flimmerepithel, das aus zwei historisch beschriebenen epithelialen Residentzellen besteht: Flimmerzellen und sekretorischen ^Zellen1,2. Das Eileiter hat drei klassisch anerkannte Segmente: das Infundibulum, die Ampulle und den Isthmus. In einer aktuellen Studie haben Harwalkar et al. ³ untersuchte die Eileitermorphologie und Genexpression, was zur Erweiterung der Kategorisierung von residenten Epithelzellen auf sieben verschiedene Populationen führte. Darüber hinaus etablierten sie die Ampullar-Isthmus-Verbindung als eigenständiges Segment des ^Eileiters3. Das hierin beschriebene Verfahren, das sich auf das Infundibulum, die Ampulle und den Isthmus konzentriert, könnte leicht erweitert werden, um auch die ampullär-isthmische Verbindung ^{einzubeziehen2,3}. Die infundibuläre Region enthält das Ostium oder die Öffnung des Eileiters und umfasst die Fimbriumregion sowie den proximalen Stiel. Wenn Sie sich in Richtung Gebärmutter bewegen, ist als nächstes die Ampulle und dann der Isthmus. Bewimmerte Zellen sind am prominentesten im distalen Ende der Region, proximal zum Eierstock oder infundibulum, während sekretorische Zellen am prominentesten im proximalen Ende oder Isthmussegment ^sind1. Im Gegensatz zum menschlichen Eileiter ist der eiförmige Eileiter eine gewundene Struktur, die von der Mesosalpinx, einer Erweiterung des breiten Ligamentiotoneums^{, getragen wird1,4}. Darüber hinaus ist das Eileiter der Maus in einem Bursalsack eingeschlossen, der die Wahrscheinlichkeit eines Eizelltransfers in das ^Eileiter4 erhöht. Die Ampulle wird als Ort der Befruchtung identifiziert, von dem aus sich entwickelnde Embryonen in den Isthmus gelangen, bevor sie in die Gebärmutter ^gelangen5. Tubensegmente haben einen Durchmesser von 200-400 μm und die längeren Ampull- und Isthmusregionen sind etwa 0,5-1,0 cm ^lang4. Die Eileiterdehnungen während des Östruszyklus und die Ampulle und das Infundibulum sind dehnungsfähiger als der Isthmus1.

Überproliferation von Zellen, insbesondere sekretorischen Zellen, charakterisieren Vorläuferläsionen zu serösen Tumoren in der ^{Beckenhöhle6}. Diese serösen intraepithelialen Läsionen entstehen im Eileiterepithel ausschließlich in der Fimbrienregion; Es ist nicht bekannt, warum die Läsionsbildung auf diese Region beschränkt ist, in der normalerweise der vorherrschende Zelltyp bewimpert und nicht sekretorisch ^ist2,7,8. Die Regionalität in Bezug auf die normale physiologische Funktion sowie das erhöhte Interesse am eiduktalen Ursprung von Eierstockkrebs9,10,11,12,13 unterstreichen die Bedeutung einer separaten Bewertung der Eileitersegmente.

Die hier beschriebene Methode beschreibt die Erfassung separater Eileitersegmente für nachfolgende nachgeschaltete Analysen der segmentspezifischen Genexpression und Funktion dissoziierter Zellen. Traditionell werden viele Gewebe für die Extraktion ganzer RNA entweder nach der Phenol: Chloroform-Methode oder einer vollständigen Extraktionsmethode auf der Säule verarbeitet. Wir fanden jedoch heraus, dass die RNA-Qualität erhalten blieb, während mit der beschriebenen Kombinationsmethode eine ausreichende Ausbeute erzielt wurde. Mit dieser Methode können sehr kleine funktionelle Segmente des Eileiters für nachgeschaltete Analysen verarbeitet werden, anstatt den Eileiter als Ganzes zu untersuchen, was die für die verschiedenen Segmente repräsentativen Ergebnisse maskieren ^kann14.

Dissoziierte murine Eileiterzellen wurden selten durch Durchflusszytometrie untersucht, höchstwahrscheinlich aufgrund der begrenzenden Zellausbeute aus diesem Gewebe. Ein Ansatz zur Überwindung dieses Problems bestand darin, Zellen zu dissoziieren, sie in Kultur zu züchten und dann die Redifferenzierung in vitro zu stimulieren, um geeignete Zellzahlen für die nachgeschaltete Zellanalyse zu erhalten15,16,17,18. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist die Zeit ex vivo und die veränderte Mikroumgebung in Kultur, die beide wahrscheinlich die Genexpression verändern. Es wird auch angenommen, dass die morphologische Redifferenzierung die gleiche transkriptionelle und proteomische Signatur aufweist wie das intakte Tier. Die derzeitige Dissoziationsmethode wurde entwickelt, um die höchste Anzahl von Epithelzellen in einer heterogenen eiduktalen Zellpopulation zu erreichen und gleichzeitig die Differenzierung einzelner Zellen beizubehalten. Darüber hinaus begrenzt der meist nicht-enzymatische Ansatz wahrscheinlich den Verlust von Zelloberflächenproteinen.

Protocol

Alle Tierhandhabungen und -verfahren wurden vom institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss der University of California, Riverside, genehmigt und entsprachen den Richtlinien der American Association for Laboratory Animal Care, des Landwirtschaftsministeriums der Vereinigten Staaten und der National Institutes of Health. Die beschriebene Methode verwendete C57BL/6 erwachsene, weibliche Mäuse. Alle Tiere wurden vor der Gewebeentnahme durch Enthauptung eingeschläfert. HINWEIS: Eine ?…

Representative Results

Das beschriebene Dissoziationsprotokoll ergibt 100.000-120.000 Zellen pro Maus mit Pooling beider Eileiter. Die Methode ist schonend genug, um mehrgliedrige Zellränder intakt zu lassen, was eine Unterscheidung zwischen multi-ciliarierten Zellen und sekretorischen Zellen ermöglicht und überprüft, ob die Verdauungsmethode sanft genug ist, um eine Dedifferenzierung zu verhindern. Repräsentative Immunfluoreszenzbilder in Abbildung 5 zeigen kleinzellige Klumpen nach Schritt 4.2.1, fixiert f?…

Discussion

Die drei Segmente des Eileiters sind histologisch, morphologisch und funktionell unterscheidbar1,2,3. Das Epithel variiert stark von einem Ende des Eileiters zum anderen. Bewimperte Zellen dominieren am fimbrialen/infundibulären Ende, während sekretorische Zellen in der isthmischen Region ^dominieren1. Während dieser Gesamtgradient seit einiger Zeit erkannt wurde, haben neuere Arbeiten mehr Unterschiede…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines