Представлен способ микродиссекции яйцевода мыши, позволяющий собирать отдельные сегменты при сохранении целостности РНК. Кроме того, описана процедура неферментативной диссоциации клеток яйцевода. Методы подходят для последующего генного и белкового анализа функционально различных сегментов яйцеводов и диссоциированных клеток яйцевода.
Мышиные модельные системы не имеют себе равных для анализа процессов заболевания из-за их генетической манипулируемости и низкой стоимости экспериментального лечения. Однако из-за их небольшого размера тела некоторые структуры, такие как яйцевод диаметром 200-400 мкм, оказались относительно трудными для изучения, кроме как с помощью иммуногистохимии. В последнее время иммуногистохимические исследования выявили более сложные различия в сегментах яйцеводов, чем было признано ранее; таким образом, яйцевод делится на четыре функциональных сегмента с различным соотношением семи различных типов эпителиальных клеток. Различное эмбриологическое происхождение и соотношение типов эпителиальных клеток, вероятно, делают четыре функциональные области дифференцированно восприимчивыми к болезням. Например, поражения-предшественники серозных интраэпителиальных карцином возникают из инфундибулума в мышиных моделях и из соответствующей фимбриальной области в фаллопиевой трубе человека. Протокол, описанный здесь, детализирует метод микродиссекции для разделения яйцевода таким образом, чтобы получить достаточное количество и чистоту РНК, необходимых для последующего анализа, такого как обратная транскрипционно-количественная ПЦР (RT-qPCR) и секвенирование РНК (RNAseq). Также описан в основном неферментативный метод диссоциации тканей, подходящий для проточной цитометрии или одноклеточного анализа RNAseq полностью дифференцированных клеток яйцевода. Описанные методы будут способствовать дальнейшим исследованиям с использованием мышиного яйцевода в области репродукции, фертильности, рака и иммунологии.
Мышиный яйцевод похож по функциям и морфологии на человеческую фаллопиеву трубу1. Оба состоят из псевдостратифицированного реснитчатого эпителия, состоящего из двух исторически описанных эпителиальных резидентных клеток: реснитчатых клеток и секреторных клеток1,2. Яйцевод имеет три классически признанных сегмента: инфундибулум, ампулла и перешеек. В недавнем исследовании Harwalkar et al. 3 исследовали морфологию яйцеводов и экспрессию генов, что привело к расширению категоризации резидентных эпителиальных клеток до семи различных популяций. Кроме того, они установили ампуллярно-перешеечное соединение как отдельный сегмент яйцевода3. Способ, описанный в настоящем описании, который фокусируется на инфундибуле, ампуле и перешейке, может быть легко расширен, чтобы включить ампуллярно-истмическое соединение, а также2,3. Инфундибулярная область содержит остиум, или отверстие яйцевода, и включает в себя фимбриальную область, а также проксимальный стебель. Двигаясь в сторону матки, далее идет ампулла, а затем перешеек. Реснитчатые клетки наиболее заметны в дистальном конце области, проксимально к яичнику или инфундибулу, в то время как секреторные клетки наиболее заметны в проксимальном конце или сегменте перешейка1. В отличие от человеческой фаллопиевой трубы, мышиный яйцевод представляет собой спиральную структуру, поддерживаемую мезосальпинксом, продолжением широкой связки брюшины1,4. Кроме того, яйцевод мыши заключен в бурсальный мешок, что увеличивает вероятность переноса ооцитов в яйцевод4. Ампула определяется как место оплодотворения, из которого развивающиеся эмбрионы переходят в перешеек перед попаданием в матку5. Трубные сегменты имеют диаметр 200-400 мкм, а более длинные ампулярии и перешейки составляют примерно 0,5-1,0 см в длину4. Яйцевод растягивается во время эстрального цикла, а ампулы и инфундибулы более различимы, чем перешеек1.
Чрезмерная пролиферация клеток, особенно секреторных клеток, характеризует поражения предшественников серозных опухолей, обнаруженных в полости малого таза6. Эти предшественники серозных интраэпителиальных поражений возникают в эпителии яйцевода исключительно в области малоберцов; неизвестно, почему образование поражения ограничено этой областью, где обычно преобладающий тип клеток является реснитчатым, а не секреторным2,7,8. Региональность с точки зрения нормальной физиологической функции, а также повышенный интерес к яйцеводному происхождению рака яичников9,10,11,12,13 подчеркивают важность отдельной оценки сегментов яйцевода.
Метод, описанный здесь, детализирует сбор отдельных сегментов яйцевода для последующего анализа экспрессии специфических для сегмента генов и функции диссоциированных клеток. Традиционно многие ткани обрабатываются для экстракции всей РНК либо по фенолу: метод хлороформа, либо метод полной экстракции на колонке; однако мы обнаружили, что качество РНК поддерживалось при получении достаточного выхода с помощью описанного комбинированного метода. Используя этот метод, очень маленькие функциональные сегменты яйцевода могут быть обработаны для последующего анализа, а не для исследования яйцевода в целом, что может маскировать результаты, репрезентативные для различных сегментов14.
Диссоциированные мышиные клетки яйцеводов редко исследовались с помощью проточной цитометрии, скорее всего, из-за предельного выхода клеток из этой ткани. Один из подходов к преодолению этой проблемы заключался в диссоциации клеток, выращивании их в культуре, а затем стимуляции редифференцировки in vitro для получения соответствующих номеров клеток для последующего анализа клеток15,16,17,18. Ограничением этого подхода является время ex vivo и измененная микросреда в культуре, оба из которых, вероятно, изменяют экспрессию генов. Существует также предположение, что морфологическая редифференцировка имеет ту же транскрипционную и протеомную сигнатуру, что и у интактного животного. Современный метод диссоциации был разработан для достижения наибольшего количества эпителиальных клеток в гетерогенной популяции яйцеводных клеток при сохранении дифференцировки одиночных клеток. Кроме того, в основном неферментативный подход, вероятно, ограничивает потерю белков клеточной поверхности.
Три сегмента яйцевода гистологически, морфологически и функционально различны1,2,3. Эпителий сильно варьируется от одного конца яйцевода к другому. Реснитчатые клетки доминируют на фимбриальном/инфундибулярном конце, в то время как се?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана премией Министерства обороны США за прорыв AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR был частично поддержан очными стипендиями: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship и Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences and University of California, Riverside, intramural awards: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant и Graduate Division Dissertation Year Program Award. Авторы благодарят Джиллиан М. Райт и Алиссу М. Кумари за помощь в раннем устранении неполадок этого метода.
0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
25G needle | BD | 305122 | |
60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20C for dissection |
Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text. |
Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |