Microdissection et dissociation de l’oviducte murin : identification de segment individuel et isolement unicellulaire

Summary

Une méthode de microdissection de l’oviducte de souris qui permet la collecte des segments individuels tout en maintenant l’intégrité de l’ARN est présentée. En outre, une procédure de dissociation des cellules oviductales non enzymatiques est décrite. Les méthodes sont appropriées pour l’analyse ultérieure des gènes et des protéines des segments oviductaux fonctionnellement différents et des cellules oviductales dissociées.

Abstract

Les systèmes de modèles murins sont inégalés pour l’analyse des processus pathologiques en raison de leur manipulabilité génétique et du faible coût des traitements expérimentaux. Cependant, en raison de leur petite taille corporelle, certaines structures, telles que l’oviducte d’un diamètre de 200 à 400 μm, se sont avérées relativement difficiles à étudier, sauf par immunohistochimie. Récemment, des études immunohistochimiques ont révélé des différences plus complexes dans les segments d’oviductes que ce qui était reconnu auparavant; ainsi, l’oviducte est divisé en quatre segments fonctionnels avec des rapports différents de sept types de cellules épithéliales distinctes. Les différentes origines embryologiques et les ratios des types de cellules épithéliales rendent probablement les quatre régions fonctionnelles différentiellement sensibles à la maladie. Par exemple, les lésions précurseurs des carcinomes intraépithéliaux séreux proviennent de l’infundibulum dans les modèles murins et de la région fimbriale correspondante dans la trompe de Fallope humaine. Le protocole décrit ici détaille une méthode de microdissection pour subdiviser l’oviducte de manière à produire une quantité et une pureté suffisantes d’ARN nécessaires à l’analyse en aval, telles que la TRANSCRIPTION inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) et le séquençage de l’ARN (RNAseq). On décrit également une méthode de dissociation tissulaire principalement non enzymatique appropriée pour la cytométrie en flux ou l’analyse RNAseq unicellulaire de cellules oviductales entièrement différenciées. Les méthodes décrites faciliteront la poursuite des recherches utilisant l’oviducte murin dans le domaine de la reproduction, de la fertilité, du cancer et de l’immunologie.

Introduction

L’oviducte murin a une fonction et une morphologie similaires à celles de la trompe de Fallope ^humaine1. Les deux sont constitués d’un épithélium cilié pseudostratifié, composé de deux cellules résidentes épithéliales décrites historiquement: les cellules ciliées et les cellules sécrétoires1,2. L’oviducte a trois segments classiquement reconnus: l’infundibulum, l’ampoule et l’isthme. Dans une étude récente, Harwalkar et al. ³ a étudié la morphologie des oviductes et l’expression des gènes conduisant à l’expansion de la catégorisation des cellules épithéliales résidentes à sept populations distinctes. En outre, ils ont établi la jonction ampullaire-isthme comme un segment distinct de l’oviducte3. La méthode décrite ici, qui se concentre sur l’infundibulum, l’ampoule et l’isthme, pourrait facilement être étendue pour inclure également la jonction ampullaire-isthmique2,3. La région infundibulaire contient l’ostium, ou ouverture de l’oviducte, et comprend la région fimbriale ainsi que la tige proximale. En se déplaçant vers l’utérus, vient ensuite l’ampoule, puis l’isthme. Les cellules ciliées sont les plus importantes à l’extrémité distale de la région, proximales de l’ovaire ou infundibulum, tandis que les cellules sécrétoires sont plus importantes à l’extrémité proximale ou au segment de l’isthme1. Contrairement à la trompe de Fallope humaine, l’oviducte murin est une structure enroulée soutenue par le mésoalpinx, une extension du large ligament ^{péritoine1,4}. De plus, l’oviducte de souris est enfermé dans un sac de bourse qui augmente la probabilité de transfert d’ovocytes dans l’oviducte4. L’ampoule est identifiée comme le lieu de fécondation, à partir duquel les embryons en développement passent dans l’isthme avant d’entrer dans l’utérus5. Les segments tubaires ont un diamètre de 200 à 400 μm et les régions ampullaires et isthmes plus longues mesurent environ 0,5 à 1,0 cm ^{de longueur4}. Les distédes d’oviductes pendant le cycle œstral et l’ampoule et l’infundibulum sont plus dissemblables que l’isthme1.

La prolifération excessive des cellules, en particulier des cellules sécrétoires, caractérise les lésions précurseurs des tumeurs séreuses présentes dans la cavité ^pelvienne6. Ces lésions intraépithéliales séreuses précurseurs apparaissent dans l’épithélium de l’oviducte uniquement dans la région fimbriale; on ne sait pas pourquoi la formation de lésions est limitée à cette région où normalement le type de cellule prédominant est cilié, et non sécrétoire2,7,8. La régionalité en termes de fonction physiologique normale, ainsi que l’intérêt accru pour l’origine oviductale du cancer de l’ovaire9,10,11,12,13, soulignent l’importance d’une évaluation séparée des segments d’oviductes.

La méthode décrite ici détaille la collecte de segments oviductaux distincts pour des analyses ultérieures en aval de l’expression et de la fonction des gènes spécifiques à un segment des cellules dissociées. Traditionnellement, de nombreux tissus sont traités pour l’extraction de l’ARN entier en suivant soit la méthode du phénol: chloroforme ou une méthode d’extraction complète sur colonne; cependant, nous avons constaté que la qualité de l’ARN était maintenue tout en produisant un rendement suffisant avec la méthode de combinaison décrite. En utilisant cette méthode, de très petits segments fonctionnels de l’oviducte peuvent être traités pour des analyses en aval plutôt que d’étudier l’oviducte dans son ensemble, ce qui peut masquer des résultats représentatifs des différents ^segments14.

Les cellules oviductales murines dissociées ont rarement été étudiées par cytométrie en flux, probablement en raison de la limitation du rendement cellulaire de ce tissu. Une approche pour surmonter ce problème a été de dissocier les cellules, de les cultiver en culture, puis de stimuler la re-différenciation in vitro pour obtenir des nombres de cellules appropriés pour l’analyse cellulaire en aval15,16,17,18. Une limite à cette approche est le temps ex vivo et le microenvironnement altéré en culture, qui modifient probablement l’expression des gènes. On suppose également que la redifférection morphologique a la même signature transcriptionnelle et protéomique que celle présente chez l’animal intact. La méthode de dissociation actuelle a été conçue pour obtenir le plus grand nombre de cellules épithéliales dans une population de cellules oviductales hétérogènes tout en maintenant la différenciation unicellulaire. De plus, l’approche principalement non enzymatique limite probablement la perte de protéines de surface cellulaire.

Protocol

Toutes les manipulations et procédures de manipulation et d’utilisation des animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Riverside et étaient conformes aux directives de l’American Association for Laboratory Animal Care, du département de l’Agriculture des États-Unis et des National Institutes of Health. La méthode décrite utilisait des souris femelles adultes C57BL/6. Tous les animaux ont été euthanasiés par décapi…

Representative Results

Le protocole de dissociation décrit donne 100 000 à 120 000 cellules par souris avec mise en commun des deux oviductes. La méthode est suffisamment douce pour laisser intactes les bordures cellulaires multi-ciliées, permettant une distinction entre les cellules multi-ciliées et les cellules sécrétoires, et vérifiant que la méthode de digestion est suffisamment douce pour empêcher la dédifférenciation. Les images représentatives de l’immunofluorescence de la figure 5 montrent d…

Discussion

Les trois segments de l’oviducte sont histologiquement, morphologiquement et fonctionnellement ^{distincts1,2,3}. L’épithélium varie considérablement d’une extrémité de l’oviducte à l’autre. Les cellules ciliées dominent à l’extrémité fimbriale/infundibulaire, tandis que les cellules sécrétoires dominent dans la région isthmique1. Bien que ce gradient global soit reconnu depuis un ce…

Materials

0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines