Summary
En metod för mikrodissection av musovidukten som möjliggör insamling av de enskilda segmenten samtidigt som RNA-integriteten upprätthålls presenteras. Dessutom beskrivs icke-enzymatiska oviductal cell dissociation förfarande. Metoderna är lämpliga för efterföljande gen- och proteinanalys av de funktionellt olika oviduktala segmenten och dissocierade oviduktala celler.
Abstract
Musmodellsystem är oöverträffade för analys av sjukdomsprocesser på grund av deras genetiska manipulabilitet och den låga kostnaden för experimentella behandlingar. Men på grund av sin lilla kroppsstorlek har vissa strukturer, såsom äggledaren med en diameter på 200-400 μm, visat sig vara relativt svåra att studera förutom genom immunohistokemi. Nyligen har immunohistokemiska studier avslöjat mer komplexa skillnader i oviduktsegment än vad som tidigare erkänts; Således är äggledaren indelad i fyra funktionella segment med olika förhållanden av sju distinkta epitelcelltyper. De olika embryological ursprung och förhållanden av epitelial celltyper sannolikt gör de fyra funktionella regionerna differentiellt mottagliga för sjukdom. Till exempel uppstår prekursorskador till serösa intraepithelial carcinom från infundibulum i musmodeller och från motsvarande fimbrial regionen i den mänskliga äggledaren. Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för mikrodissection för att dela upp äggledaren på ett sådant sätt att den ger en tillräcklig mängd och renhet av RNA som är nödvändig för nedströmsanalys såsom omvänd transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) och RNA-sekvensering (RNAseq). Också beskrivs är en mestadels icke-enzymatiska vävnad dissociation metod lämplig för flöde cytometri eller en cell RNAseq analys av fullt differentierade oviductal celler. De beskrivna metoderna kommer att underlätta ytterligare forskning med hjälp av murinovidukten inom reproduktion, fertilitet, cancer och immunologi.
Introduction
Murinovidukten liknar funktion och morfologi till det mänskliga äggledaren1. Båda består av en pseudostratified ciliated epitelium, bestående av två historiskt beskrivna epitelial bosatta celler: ciliated celler och sekretoriska celler1,2. Ovidukten har tre klassiskt erkända segment: infundibulum, ampulla och näset. I en ny studie, Harwalkar et al. 3 undersökt oviduct morfologi och genuttryck som leder till expansion av kategorisering av bosatta epitelceller till sju distinkta populationer. Dessutom etablerade de ampullary-isthmus korsningen som ett distinkt segment av oviduct3. Metoden som beskrivs häri, som fokuserar på infundibulum, ampulla och näs, skulle lätt kunna utvidgas till att omfatta den ampullära istmiska korsningen också2,3. Den infundibulära regionen innehåller ostium, eller öppning av ovidukten, och inkluderar fimbrialregionen samt den proximala stjälken. Rör sig mot livmodern, nästa är ampulla, och sedan näset. Ciliated celler är mest framträdande i den distala änden av regionen, proximal till äggstocken eller infundibulum, medan sekretoriska celler är mest framträdande i proximal ände eller näs segmentet1. Till skillnad från det mänskliga äggledaren är murinovidukten en spiralformad struktur som stöds av mesosalpinx, en förlängning av det breda ligamentet peritoneum1,4. Dessutom är musovidukten innesluten i en bursalsäck som ökar sannolikheten för äggcellöverföring till äggledaren4. Ampulla identifieras som platsen för befruktning, från vilken utvecklande embryon passerar in i näset innan de går in i livmodern5. Tubalsegmenten är 200-400 μm i diameter och de längre ampullära och näsregionerna är cirka 0,5-1,0 cm långa4. Oviduct distends under den estrous cykeln och ampulla och infundibulum är mer distensible än isthmus1.
Över spridning av celler, särskilt sekretoriska celler, karakteriserar prekursor skador till serösa tumörer som finns i bäckenhålorna hålighet6. Dessa prekursor serous intraepithelial organskador uppstår i oviduct epitelium endast i fimbrial regionen. det är okänt varför lesion bildas är begränsad till denna region där normalt den dominerande celltypen är ciliated, inte secretory2,7,8. Regionaliteten när det gäller normal fysiologisk funktion, liksom ökat intresse för äggledscancerns oviduktala ursprung9,10,11,12,13, understryker vikten av separat utvärdering av äggledarens segment.
Metoden som beskrivs här beskriver insamlingen av separata oviductal segment för efterföljande nedströms analyser av segment-specifika gen uttryck och funktion av dissociated celler. Traditionellt bearbetas många vävnader för hela RNA-extraktion efter antingen fenol: kloroformmetod eller en komplett extraktionsmetod på kolonnen; Vi fann dock att RNA kvalitet bibehölls samtidigt som det gav tillräcklig avkastning med den beskrivna kombinationsmetoden. Med hjälp av denna metod kan mycket små funktionella segment av äggledaren bearbetas för nedströmsanalyser snarare än att undersöka äggledaren som helhet, vilket kan maskera resultat som är representativa för de olika segmenten14.
Dissociated murine oviductal celler har sällan undersökts av flöde cytometri, troligen på grund av att begränsa cellutbytet från denna vävnad. Ett tillvägagångssätt för att övervinna detta problem har varit att separera celler, odla dem i kultur och sedan stimulera återdifferentiering in vitro för att få lämpliga cellnummer för nedströms cellanalys15,16,17,18. En begränsning till detta tillvägagångssätt är tid ex vivo och förändrad mikromiljön i kultur, som båda sannolikt förändra genuttryck. Det finns också ett antagande att morfologiska re-differentiering har samma transkriptionella och proteomiska signatur som var närvarande i det intakta djuret. Den nuvarande dissociation metoden utformades för att uppnå det högsta antalet epitelial celler i en heterogen oviductal cell population samtidigt upprätthålla en enda cell differentiering. Vidare begränsar den mestadels icke-enzymatiska metoden sannolikt förlusten av cellytans proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurhantering och djurprocedurer godkändes av University of California, Riverside institutional animal care and use committee och var i enlighet med riktlinjer från American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture och National Institutes of Health. Den beskrivna metoden används C57BL/6 vuxna, kvinnliga möss. Alla djur avlivades genom halshuggning före vävnadsskörd.
OBS: En översikt över protokollet, som använder ett blått färgämne för att hjälpa till med effektiv dissekering och frifärgning av äggledaren, visas i den första figuren (figur 1).
Bild 1: Översikt över mikrodissectionmetoden. (A) Vänster panel visar den intakta struktur från vilken de flesta äggstocksfettdyna och rester av bindväv som omger äggledaren har avlägsnats. Därefter hjälper tillsatsen av toluidinblå att skilja ovidukens spolar (mittenpanelen). Höger panel visar strukturer efter avlägsnandet av äggstocken. B) En okyld ovidukt med interna svängar för att bestämma var varje segment börjar och slutar. C) Tecknad film av den segmentering som används (inte ritad i skala). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
1. Beredning av dissekeringsytan
- Fäst en bit tandvax på en Petriskål med lim och låt den torka (figur 2A). Sanera skålen med 70% etanol. Ytan är klar för dissekering.
2. Makrodissection av äggstocken, äggledaren och livmodern
- Immobilisera petriskålen som innehåller tandvaxet på valfri kall plattform (t.ex. en ispåse som hålls vid -20 °C före användning) under ett dissekeringsmikroskop när den är klar för dissekering (figur 2A).
- Desinficera djurets ventrala yta med 70% etanol. Öppna buk- och bäckenhålan med steril dissekeringssax och flytta mag-tarmkanalen åt ena sidan för att lokalisera den dorsala bihornala livmodern. Följ varje livmoderhornlista för att hitta varje äggledare och äggstock insvept i livmoderfettkudden, som finns strax under njuren (figur 2B,C).
- Punkt punkt både laterala ovidukter med äggstockarna och en del av det distala livmoderns horn som fortfarande är fastsatta med dissekeringssax. Skär varje lateralt livmoderhorn med cirka 1-2 cm av hornet fortfarande fastsatt på den hoprullade äggledaren och äggstocken (figur 2D). Sänk ner vävnaden omedelbart i 2 ml kall dissekeringsmedium (se Materialtabell).
Bild 2: Makrodissection av äggstocken och dissekeringsinställningen. Äggledaren ligger dorsally i bäckenhålan vid basen av njuren i äggstocksfettkudden (B). Lokalisera livmoderbifurcation i bäckenhålan (C) och följ laterala livmoderns horn för att lokalisera livmodern-oviduct-äggstockkontinuum (B). Ta bort dessa strukturer genom att skära genom ett livmoderhorn och grov dissekering. Placera på dissekeringsplattformen (A) och fäst livmoderdelen på tandvax med en nål (A och D). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
OBS: Lämna tillräckligt med livmoderhorn intakt och fäst vid äggledaren för att möjliggöra anbringning på dissekeringsplattformen (figur 2D).
- Fäst livmodervävnaden på tandvaxet med en steril 25 G-nål för att säkra vävnaden för dissekering (figur 2A, D och figur 3A). Arbeta under dissekeringsmikroskopet, rengör och dissekera bort äggstocksfettplattan och bindväven för att möjliggöra tydlig visualisering av äggledaren (figur 3B).
Figur 3: Steg för steg oviduktmikrodissection. Efter avlägsnande av kvarvarande fett och bindväv (A,B), tillsätt toluidinblått till vävnaden (C) och tvätta sedan bort för att underlätta visualisering och efterföljande avlägsnande av äggstocken och uncoiling av röret (D-H). Infundibulum finns bredvid proximal näs och livmoder-tubal junction (UTJ). Dra lätt den distala änden medan du skär vid mesosalpinx till uncoil och avslöja de endogena svängarna av ovidukten (H) för att orientera för lämplig segmentering. Figur A-C skalstång = 500 μm, D-H skalstång = 400 μm (I) Tecknad film av de olika segmenten (inte ritad i skala). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Använd en 1 ml spruta, dispensera och inkubera ovidukten fäst på livmodern i 1-2 droppar steril 1% toluidin blå färglösning i 30 s-1 min. Skölj med kall Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) och avlägsna all vätska (figur 3C).
- Dra lätt äggstocken från den hoprullade äggledaren och skär bort vid bursalamembranet och det breda ligamentet för att avlägsna äggstocken från äggledaren utan att kompromissa med tubvävnaden (figur 3D,E).
OBS: Äggstocken är inte fäst vid äggledaren utan innesluten i bursala membranet med äggledaren (figur 2D) och ansluten till livmoderns laterala sida via det breda ligamentet.
3. Mikrodissection och segmentering av äggledaren
- Lokalisera den distala, fimbrial änden av äggledaren som finns lateralt till livmodern-tubal korsningen (UTJ). Ovidukspolarna tillbaka på sig själv; Därför kan fimbrialänden placeras i sidled till den proximala änden och är en lämplig utgångspunkt för att orientera för att lossa äggledaren (figur 3F,I).
- När du försiktigt drar i röret, skär bort vid mesosalpinx (figur 3I) med mikrosax i fjäderform för att lossa äggledaren (figur 3G).
- När röret är okylt skär du röret för att producera de infundibulära, ampullära och isthmic regionerna (figur 3H).
- Efter excision av infundibulum (fimbrial ände och proximal stjälk), punkt punkt den ampullära regionen genom att skära efter den andra framträdande svängen av röret (skär mellan varv två och tre, ca 1 cm i längd). Slutligen skär du den återstående delen till UTJ, som är den istemiska regionen (figur 3H).
OBS: Äggledaren kommer inte att helt lossna i en rak struktur. Röret bibehåller sina varv (figur 3H)3. Baserat på de följande svängarna efter ampullary regionen, kan man ytterligare segmentera det återstående röret i den ampullary-isthmic korsningen och isthmus3. Efter ampulla excision, skär mellan varv fem och sex för att erhålla den ampullary-isthmic korsningen; det återstående röret (vrid sex till början av UTJ) är näset3.
- Efter excision av infundibulum (fimbrial ände och proximal stjälk), punkt punkt den ampullära regionen genom att skära efter den andra framträdande svängen av röret (skär mellan varv två och tre, ca 1 cm i längd). Slutligen skär du den återstående delen till UTJ, som är den istemiska regionen (figur 3H).
- Omedelbart snap frys dissekerade vävnad segment i flytande kväve för RNA isolering eller fixa och bearbeta varje segment för orienterad inbäddning och immunohistological analys.
- Tillsätt 200 μL reagens för kall RNA-extraktionsextraktion och 1:1 homogeniseringspärlablandning (se Tabell över material) i vävnaden om du fortsätter med RNA-extraktion (se steg 5.1).
4. Oviduct dissociation
- Fortsatt från steg 3.1.1 ovan) För optimal dissociation av epitelet, skär upp äggledaren i de områden där det är möjligt (dvs. infundibulum och ampulla) för att exponera det lysande epitelet (figur 4A).
Figur 4: Oviductcells dissociation, del 1. Tecknad film som visar hur man exponerar distala epitel för optimal cellavsociation (A) och en bild som visar det enklaste sättet att använda 1 mm2-nätet (B). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Börja vid fimbrialområdet, med tång som hävstång, skär röret längsgående med vårformssax.
- Hacka de slitsöppna delarna och den återstående äggledaren i segment (~1-2 mm i storlek) och tillsätt 5 ml varm, icke-enzymatisk dissociationsbuffert (se Materialtabell) och inkubera vid 37 °C.
- Återanvänd vävnadsbitarna och dissocierade celler med en glödlampa pipettor var 3: e minut i 9-10 min. Späd dissociationsbufferten 1:1 med kall dissekeringsmedium.
- Samla cellerna genom centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C). Återanvänd cellerna i 2 ml RBC-lysbuffert i 2 min vid rumstemperatur och späd sedan 1:1 med kallt dissekeringsmedel.
- Samla cellerna genom centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) och återanvänds i 5 ml kall pronaslösning.
- Inkubera i pronase matsmältningsmedium och återanvända cellklumparna med en glödlampa pipettor var 3-5 min tills en enda cell suspension uppnås (~ 25-30 min).
OBS: Detta steg utförs bäst i en vävnadsodlingsplatta eller flaskv för att möjliggöra konstant observation som förhindrar onödig överexponering för att pronase.
- Inkubera i pronase matsmältningsmedium och återanvända cellklumparna med en glödlampa pipettor var 3-5 min tills en enda cell suspension uppnås (~ 25-30 min).
- För cellerna genom ett sterilt makronät (1 mm x 1 mm maska fäst på ett koniskt rör med ett gummiband (figur 4B)) för att avlägsna eventuella återstående odissocierade vävnadsbitar. Samla cellerna genom centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) och återanvänd dem i ett kallt medium som är lämpligt för nedströmsanalys (t.ex. FACS-buffert om man fortsätter med färgning för flödescytometri).
5. RNA-utvinning av oviduktala segment
- Homogenisera snapfrysta prover i 200 μL RNA-extraktionsreagens i en pärlblandare vävnad homogenisator på nivå 12 under två intervall (3 min vardera) vid 4 °C med hjälp av den rostfria pärlblandningen.
OBS: För att bevara RNA-integriteten bör proverna omedelbart flyttas från snapfryst tillstånd till RNA-extraktionsreagens och inte vägas. - Centrifugera homogenatet vid 100-200 x g i en bordscentrifuger i cirka 5 s vid rumstemperatur för att separera vätskan från pärlorna. Överför supernatanten till ett nytt rör.
- Tillsätt ytterligare 200 μL RNA-extraktionsreagens till pärlorna för att återvinna fler prover, följt av centrifugering (100-200 x g, 5 s, rumstemperatur). Kombinera supernatanterna.
OBS: Använd en liten pipettspets (de flesta p200-spetsar är lämpliga) för att förhindra att pärlan överser vid borttagning av supernatanten. - Följ tillverkarens riktlinjer för att fasa ut och fälla ut RNA. Representativa prover fälldes ut över natten vid -20 °C med 100% isopropanol (cirka 2:1 volym, isopropanol: återvunnen vattenfas).
- Överför hela RNA-fällningen tillsammans med lösningen till en RNA-bindande spinnkolonn och centrifug i 30 s vid 9 500 x g. Rena RNA-kolumnen enligt tillverkarens riktlinjer och elute sedan RNA i 20 μL nukleasfritt vatten. Utvärdera kvalitet/kvantitet på en mikrovolumspektrofotometer och/eller bioanalysator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrivna dissociationsprotokollet ger 100 000-120 000 celler per mus med poolning av båda äggledaren. Metoden är skonsam nog att lämna multikilierade cellgränser intakta, vilket möjliggör en åtskillnad mellan multikilierade celler och sekretoriska celler, och verifierar att matsmältningsmetoden är skonsam nog att förhindra avdifferentiering. Representativa immunofluorescensbilder i figur 5 visar småcellsklumpar efter steg 4.2.1, fixerad i 3 min i 4% paraformaldehyd (PFA)/ DPBS, tvättad med 1% bovint serumalbumin (BSA)/ Tris-buffrad saltlösning-tween (BTBST) och färgade i suspension. Kort, celler var permeabilized för 15 min vid rumstemperatur i 0,5% TritonX-100/BTBST, tvättas i BTBST, släckt för bakgrund fluorescens för 2 h vid rumstemperatur i 20 mM glycin / DPBS, tvättas i BTBST, och sedan blockeras i 1 h vid rumstemperatur i 5% BSA / 0,1% TritonX-10. Cellerna inkuberades sedan i den primära antikroppen vid 4 °C över natten i BTBST (mus antimus occludin (1:2000); kanin antimus acetytylerad tubulin (1:1000)) följt av flera tvättar i BTBST. Sekundär antikropp tillsattes i 1 h vid rumstemperatur i BTBST (get antimus IgG Alexa Fluor 555 (1:1000); get antikanin IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)), tvättas flera gånger i BTBST, en gång i DPBS, och sedan inkuberas i nukleär fläck i 20 min vid rumstemperatur (1:2000, Hoescht 3334). Cellerna återanvänds i 80 μL antifade montering medium och lämnades över natten i mörkret före bildbehandling (figur 5A). Bild 5B visar celler i slutet av dissociationsprotokollet. Lönsamhetsbedömningar gjordes i hela protokollet och representativa bilder visas i figur 5B-D. Propidiumjodid tillsattes vid utspädning 1:100, och celler observerades omedelbart på ett inverterat sammansatt fluorescensmikroskop (figur 5C, röd fläck). Cilia förblev intakt i små cellkluster (figur 5A) och encelliga suspensioner (figur 5E) med många celler som observerats ha cilia fortfarande slå (Suppl. Video 1).
Figur 5: Oviductcells dissociation, del 2. Fluorescerande och faskontrastbilder av ett cellkluster som är positivt för ocklusin (röd), kärnor (blå) och acetyated tubulin (grön). Den ciliated apikala gränsen (grön i AI och AV) förblir intakt under hela protokollet och tål ytterligare matsmältning till enstaka celler (E). AI: merge, AII: röd kanal, AIII: blå kanal, AIV: faskontrast, AV: grön kanal. Efter en kort pronasinkubation är majoriteten av cellerna enkla. Propidiumjodid (PI) färgning visar cirka 93% livskraft. (B) Ljust fält, C) pi-positivt ljust ljust, D) sammanslagning. (E) Infälld vid sammanfogning visar en intakt cilierad kantlinje på en enda dissocierad cell. Sådana celler hade aktivt slagit cilia (se Suppl. Video 1). Bilder togs på en inverterad sammansatt fluorescens mikroskop. Figur AI-V skalstång = 20 μm, B-D skalstång = 50 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Det beskrivna RNA-isoleringsprotokollet ger tillräcklig avkastning och renhet som krävs för segmental RT-qPCR och RNAseq. Resultaten visar att denna metod ger 800–1200 NG RNA per segment (figur 6A) med undantag för infundibulära prover där poolning från två djur kan vara nödvändig för lämplig avkastning för nedströmsanalyser. De presenterade resultaten för infundibulum är poolade från två djur, totalt fyra infundibulära regioner (figur 6). Detta protokoll är framgångsrikt för att uppnå rent RNA, initialt analyserat av mikrovolum spektrofotometer och vidare av bioanalyzer (figur 6B, C). Proverna har ett absorptionsförhållande på 260/280 nm mellan 1,8 och 2,0 (figur 6B) som är typiska för rena RNA-nukleotidarter19. Absorptionskvoter (260/230 nm) togs för varje prov med ett inklusionskriterium mellan 1 och 2,2, vilket är representativt för begränsad kontaminering från isoleringsreagenser (data som inte visas)19. Bioanalysering av proverna visade hög integritet hos RNA, med bedömt RNA-integritetsnummer (RIN) över sju (figur 6C), lämpligt för nedströms uttryck och sekvenseringsanalys20.
Figur 6: Kvalitetsbedömning av segmentalt RNA. Hela RNA bedömdes för utbyte (A) och kvalitet (B,C) av mikrovolum spektrofotometer och bioanalyzer. RIN: RNA-integritetsnummer, bedömt av bioanalyzern. Staplar är medelvärdet ± standardavvikelse (SD), N = 12 prover per segment från två separata RNA-extraktioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande video 1: Live cell imaging av slå cilia på dissocierade celler. Slå cilia efter pronase matsmältning. Videor togs på ett inverterat sammansatt mikroskop. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tre segmenten av äggledaren är histologiskt, morfologiskt och funktionellt distinkt1,2,3. Epitelet varierar kraftigt från ena änden av äggledaren till den andra. Ciliated celler dominerar vid fimbrial/infundibular änden, medan sekretoriska celler dominerar i den isthmic regionen1. Även om denna övergripande gradient har erkänts under en tid, har det senaste arbetet avslöjat fler skillnader mellan oviduktala segment. Således, medan ciliated celler blir mindre frekventa mot den proximala änden av röret, det finns en kraftig minskning av deras antal (från cirka 60% till 10% ciliation) övergång från ampulla till ampullary-isthmic junction3. Vidare härleds epitelcellpopulationer i de proximala och distala segmenten från utvecklingsmässigt distinkta härstamningar1,2,3. Distala epitelceller i infundibulum och ampulla bidrar inte till proximala epitelcellpopulationer i näset, vilket framgår av härstamning av epitelmarkörer. Vid embryonal dag 12,5 (E12.5) har oviduktala epitelceller en distinkt härstamning oberoende av den proximala epitelcellmarkören PAX22. Dessa upptäckter, förutom den olika cellpopulationen bland de olika segmenten, betonar ytterligare behovet av att undersöka segmenten självständigt. Den beskrivna metoden beskriver ett steg-för-steg-avvecklings- och segmentidentifieringsprotokoll enligt de tre historiskt beskrivna segmenten (infundibulum, ampulla och isthmus). På grund av den nyligen inrättade den ampullära istmiska korsningen som ett slutgiltigt oviduktsegment prioriterades identifiering och insamling av de tre klassiskt beskrivna områdena. Metoden kan dock utvidgas till att omfatta en separat samling av den ampullära istmiska korsningen, enligt beskrivningen ovan3.
Användningen av det blå färgämnet och placeringen av infundibulum är ett kritiskt steg för att varva ner äggledaren på ett snabbt och effektivt sätt. Det blå färgämnet belyser rörets ostium och spolar, vilket möjliggör en snabbare och effektivare avspolning och insamling. Ostiumets ursprungliga placering orienterar en till de distala (infundibular) och proximala (istmiska) områdena i äggledaren under hela uncoiling. Dessutom, att hålla proximala livmoderns horn delen fäst på dissekeringsplattformen under uncoiling gör det möjligt för kirurgen att använda båda händerna för de känsliga dissekeringsstegen. Inledande avlägsnande av den spiralformade äggledaren och försök att lossa denna struktur utan att göra röret orörligt eller utan användning av färgämnet kan lätt leda till förvirring om de distala och proximala ändarna eller orsaka brott i röret. Rörbrott är lätt, så försiktighet måste iakttas vid okrossning eftersom brott kommer att göra reproducerbar segmentering ouppnåelig. Användningen av högkvalitativa mikrosaxar i fjäderform rekommenderas starkt för att uppnå bästa resultat.
Utvärdering av genuttryckssignaturen i de olika segmenten av äggledaren, till exempel under den estrous cykeln och som svar på administrerade hormoner och cytokiner, kommer sannolikt att ge en mycket bättre förståelse för hur äggledaren förändras som svar på dessa stimuli. Dessa data kan också belysa vilka faktorer som bidrar till epitelomvandling. RNA extraktion protokollet häri utvecklades för att erhålla högsta möjliga mängd och kvalitet för denna vävnad av begränsad storlek och motståndskraftiga tubal struktur. Den beskrivna homogenisering, RNA nederbörd och konjunktion användning av fenol: kloroform och on-column rening metoder konstaterades vara mest effektiva för att uppnå lämplig kvalitet och kvantitet av RNA för nedströms analys. Oviductal segmenten vägdes inte och hela segment behandlades omedelbart för vävnad homogenisering för att förhindra uppvärmning av vävnaden leder till RNA nedbrytning. Eftersom de små rörsegmenten kräver flera homogeniseringssteg är det dessutom viktigt att säkerställa att homogenisering utförs vid 4 °C för att bevara provintegriteten. Eftersom denna metod är tillräcklig för att producera lämplig avkastning för nedströms analys, en framtida tillämpning av denna teknik skulle vara att utföra segmental RNAseq, tidigare inte rapporteras, vilket skulle bidra mycket till vår förståelse av oviduct fysiologi.
Under utvecklingen av cellen dissociation protokollet fann vi att robusta och/eller långa enzymatiska matsmältningar orsakade påvisbar förlust av cilia. Vi koncentrerade oss därför på utvecklingen av och uppnådde en metod som bevarade cellmorfologin. Förbättringar i encellsutbyte, som beskrivs häri, kommer att möjliggöra mer robusta och omedelbara multiplexerade analyser av de olika epitel- och stromalcelltyperna efter flödescytometri. Användning av ett icke-enzymatiskt dissociation protokoll följt av en kort inkubation i pronase är också sannolikt att förbättra bevarandet av cell ytan antigener över dissociation metoder med hjälp av långa eller robusta matsmältningsmetoder2,18. Encellig sekvenseringsanalys kräver mycket färre celler jämfört med multiplexerade flödescytometripaneler2,21. Så encellssekvensering av de tre beskrivna segmenten av äggledaren kan vara möjligt med det beskrivna protokollet.
Eftersom äggledaren inte kan arkiveras längs hela sin längd kan en potentiell begränsning av den nuvarande metoden vara att celler som bildar epitelet i det smalare näset skulle ha minskat exponeringen för dissociationreagenserna och därför kanske inte förekommer i den slutliga suspensionen i samma proportion som in vivo.
På grund av oviduktens spolening kan orientering för immunohistokemiska analyser av alla oviduktala segment vara utmanande3. Den beskrivna segment dissekeringen följt av orienterad inbäddning av oviductal segment möjliggör dock mer omfattande longitudinell och tvärsnitt bild analys utan att behöva seriellt avsnitt genom hela intakta coiled röret. Vidare hjälper det blå färgämnet som används för uncoiling i rätt riktning under inbäddning av de små tubalsegmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av en DoD Breakthrough Award till AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR stöddes delvis av intramural stipendier: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship och Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences och University of California, Riverside, intramural awards: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant och Graduate Division Dissertation Year Program Award. Författarna tackar Gillian M. Wright och Alyssa M. Kumari för hjälp med tidig felsökning av denna metod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).
- Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
- Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
- Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
- Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
- Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
- Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
- Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
- Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).
- Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).
- Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298 (2017).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).
