Summary

Brug af optogenetik til at vende neuroplasticitet og hæmme kokainsøgning hos rotter

Published: October 05, 2021
doi:

Summary

De her beskrevne metoder skitserer en procedure, der anvendes til optogenetisk omvendt kokaininduceret plasticitet i et adfærdsrelevant kredsløb hos rotter. Vedvarende lavfrekvent optisk stimulering af thalamo-amygdala synapser inducerer langvarig depression (LTD). In vivo optogetisk induceret LTD hos kokainerfarne rotter resulterede i den efterfølgende svækkelse af cue-motiveret stofsøgning.

Abstract

Denne protokol demonstrerer de trin, der er nødvendige for at bruge optogenetiske værktøjer til at vende kokaininduceret plasticitet ved thalamo-amygdala-kredsløb for at reducere efterfølgende kokainsøgende adfærd hos rotten. I vores forskning havde vi fundet ud af, at når rotter selv administrerer intravenøs kokain parret med et audiovisuelt signal, bliver synapser dannet ved input fra thalamusens mediale genikulatkerne (MGN) på de vigtigste neuroner i lateral amygdala (LA) stærkere, efterhånden som cue-kokainforeningen læres. Vi antog, at reversering af den kokaininducerede plasticitet ved disse synapser ville reducere cue-motiveret kokainsøgende adfærd. For at opnå denne type neuromodulation in vivo ønskede vi at fremkalde synaptisk langvarig depression (LTD), hvilket reducerer styrken af MGN-LA-synapser. Til dette formål brugte vi optogenetik, som tillader neuromodulering af hjernekredsløb ved hjælp af lys. Den excitatoriske opsin oChiEF blev udtrykt på præsynaptiske MGN-terminaler i LA ved infusion af en AAV indeholdende oChiEF i MGN. Optiske fibre blev derefter implanteret i LA, og 473 nm laserlys blev pulseret med en frekvens på 1 Hz i 15 minutter for at inducere LTD og omvendt kokaininduceret plasticitet. Denne manipulation giver en langvarig reduktion i evnen hos signaler forbundet med kokain til at fremkalde narkotikasøgningshandlinger.

Introduction

Stofmisbrug er et meget alvorligt folkesundhedsproblem i USA og over hele verden. På trods af årtiers intens forskning er der meget få effektive terapeutiske muligheder 1,2. Et stort tilbageslag for behandling er, at kronisk stofbrug genererer langsigtede associative minder mellem miljømæssige signaler og selve stoffet. Geneksponering for narkotikarelaterede signaler driver fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, der motiverer fortsat stofbrug og tilbagefald3. En ny terapeutisk strategi er at vedtage hukommelsesbaserede behandlinger, der sigter mod at manipulere de kredsløb, der er involveret i regulering af lægemiddel-cue foreninger. For nylig blev det observeret, at synapser i lateral amygdala (LA), specifikt dem, der stammer fra thalamus mediale genikulatkerne (MGN), styrkes ved gentagen cue-associeret kokain-selvadministration, og at denne potensering kan understøtte kokainsøgende adfærd 4,5. Derfor blev det foreslået, at cue-induceret genindsættelse kunne dæmpes ved at vende plasticitet ved MGN-LA synapser.

Evnen til præcist at målrette den synaptiske plasticitet af et specifikt hjernekredsløb har været en stor udfordring for feltet. Traditionelle farmakologiske værktøjer har haft en vis succes med at reducere tilbagefaldsadfærd, men er begrænset af manglende evne til at manipulere individuelle synapser. Den seneste udvikling af in vivo optogenetik har imidlertid givet de nødvendige værktøjer til at overvinde disse begrænsninger og kontrollere neurale veje med tidsmæssig og rumlig præcision 6,7,8. Ved at udtrykke lysfølsomme opsiner i et specifikt hjernekredsløb kan laserlys derefter bruges til at aktivere eller hæmme kredsløbet. Frekvensafhængig optisk stimulering kan bruges til specifikt at manipulere kredsløbets synaptiske plasticitet i et dyr, der opfører sig.

Dette manuskript skitserer den procedure, der er taget for at manipulere det adfærdsmæssigt relevante MGN-LA-kredsløb ved hjælp af in vivo optogenetik. For det første blev excitatorisk opsin oChIEF udtrykt i MGN, og optiske fibre blev bilateralt implanteret i LA. Dyr blev derefter trænet til selv at administrere kokain på en cue-afhængig måde, hvilket forstærker MGN-LA-vejen. Dernæst blev vedvarende, lavfrekvent stimulering med 473 nm laserlys brugt til at producere kredsløbsspecifik LTD. At vende plasticiteten induceret af kokainbrug genererede en langvarig reduktion i signalernes evne til at udløse handlinger, der er forbundet med stofsøgende adfærd.

Protocol

Eksperimenterne beskrevet i denne protokol var i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af University of Pittsburghs Institutional Animal Care and Use Committee. Alle procedurer blev udført med voksne, naive Sprague-Dawley rotter, der vejede 275-325 g ved ankomsten. 1. Konstruktion af optiske fiberimplantater og patchkabler Forbered optiske fiberimplantater efter …

Representative Results

En tidslinje, der skitserer rækkefølgen af eksperimenter, er vist i figur 1. Gennem adfærdseksperimenter tjener antallet af kokaininfusioner samt antallet af reaktioner på den aktive håndtag som et mål for intensiteten af kokainsøgende adfærd. I løbet af de første dage af kokainselvadministration bør antallet af aktive reaktioner gradvist stige i løbet af hver erhvervelsesdag, før det stabiliseres i løbet af den anden uge. Omvendt bør inaktive løftestangsresponser forblive la…

Discussion

Som beskrevet ovenfor er der flere kritiske trin, der er vigtige for at opnå de rette eksperimentelle resultater. Protokollen vil sandsynligvis kun være effektiv i dyr, der korrekt erhverver kokain selvadministration, og til dato er den kun blevet testet ved hjælp af de parametre, der er skitseret ovenfor. Det er muligt, at kokaindosis, forstærkningsplan og cue-parametre kan ændres med sandsynlig lille effekt på adfærdsmæssige resultater, med den undtagelse, at en andenordens forstærkningsplan kan føre til amyg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra USPHS-tilskud K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) og Pennsylvania Department of Health.

Materials

0.9% Saline Fisher Scientific NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) #268 See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) Duke Viral Vector Core Control See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) Covetrus 70349
ATP Magnesium Salt Fisher Scientific A9187
Betadine Butler Schein 38250
Calcium chloride Fisher Scientific C1016
Cesium chloride Fisher Scientific 289329
Cesium hydroxide Fisher Scientific 516988
Cesium methanesulfonate Fisher Scientific C1426
Cocaine HCl NIDA Drug Supply Center 9041-001
Cryostat Leica CM1950
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
DMSO Fisher Scientific BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344C
EGTA Fisher Scientific E3889
Ethanol University of Pittsburgh Chemistry Stockroom 200C5000
Ferrule Dust Caps Thor Labs CAPL White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves Doric Lenses F210-3011 Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules Precision Fiber Products MM-FER2007C-2300 Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic Thor Labs FP200URT 200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint Prizmatix (Ordered from Amazon) 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool Thor Labs T12S21
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057
Gentamicin Henry Schein 6913
GTP Sodium Salt Fisher Scientific G8877
Hamilton syringe Hamilton 80085 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun Allied Electronics 972-6966 250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy Precision Fiber Products PFP-353ND-8OZ
Heparin Henry Schein 55737
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrochloric Acid Fisher Scientific 219405490
Isoflurane Henry Schein 29405
Ketamine HCl Henry Schein 55853 Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s Henry Schein 9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler OEM Laser Systems BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione Fisher Scientific G4251
Lidocaine Butler Schein 14583
Light Sensor Thor Labs PM100D Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive Grainger 5E207
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition Molecular Devices MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump Harvard Apparatus 70-4501 Dual syringe
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-200/ROE-200
Microscope Olympus BX51WI Upright microscope for electrophysiology
Microscope Olympus BX61VS Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004
Orthojet dental cement, liquid Lang Dental 1504BLK black
Orthojet dental cement, powder Lang Dental 1530BLK Contemporary powder, black
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch Cables Thor Labs FP200ERT Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin Fisher Scientific AC131210010
Polishing Disc Thor Labs D50FC
Polishing Pad Thor Labs NRS913 9" x 13"
Polishing Paper Thor Labs LFG5P 5 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG3P 3 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG1P 1 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG03P 0.3 μm grit
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Fisher Scientific P5958
Potassium methanesulfonate Fisher Scientific 83000
QX-314-Cl Alomone Labs Q-150
Rimadyl (Carprofen) Henry Schein 24751
Self-Administration Chambers/Software Med Associates MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1064980500
Sodium L-Ascorbate Sigma-Aldrich A7631
Sodium Pentobarbital Henry Schein 24352
Sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphocreatine Fisher Scientific P7936
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Stainless steel machine screws WW Grainger  6GB25 M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules Thor Labs XCL
Stereotaxic Frame Stoelting 51603
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride Fisher Scientific T2265
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Vetbond Tissue Adhesive Covetrus 001505
Vibratome Leica VT1200S
Xylazine Butler Schein 33198

References

  1. Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
  2. Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
  3. Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
  4. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
  5. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
  6. Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  7. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  8. Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  9. Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
  10. Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
  11. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  12. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
  13. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  14. Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
  15. Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
  16. Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
  17. Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
  18. Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
  19. Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
  20. Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
  21. Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  22. Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
  23. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
  24. McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
  25. Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
check_url/63185?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats. J. Vis. Exp. (176), e63185, doi:10.3791/63185 (2021).

View Video