Verwendung von Optogenetik zur Umkehrung der Neuroplastizität und zur Hemmung der Kokainsuche bei Ratten
Summary
Die hier beschriebenen Methoden skizzieren ein Verfahren, mit dem die Kokain-induzierte Plastizität in einem verhaltensrelevanten Schaltkreis bei Ratten optogenetisch umgekehrt wird. Eine anhaltende niederfrequente optische Stimulation der Thalamo-Amygdala-Synapsen induziert eine langfristige Depression (LTD). In vivo führte eine optogenetisch induzierte LTD bei Kokain-erfahrenen Ratten zu einer anschließenden Abschwächung der Cue-motivierten Drogensuche.
Abstract
Dieses Protokoll zeigt die Schritte, die erforderlich sind, um optogenetische Werkzeuge zu verwenden, um die Kokain-induzierte Plastizität an Thalamo-Amygdala-Schaltkreisen umzukehren, um das nachfolgende Kokainsuchverhalten bei der Ratte zu reduzieren. In unserer Forschung hatten wir herausgefunden, dass, wenn Ratten intravenöses Kokain gepaart mit einem audiovisuellen Hinweis selbst verabreichen, Synapsen, die an Eingängen aus dem medialen genikulären Kern des Thalamus (MGN) auf die Hauptneuronen der lateralen Amygdala (LA) gebildet werden, stärker werden, wenn die Cue-Kokain-Assoziation erlernt wird. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Umkehrung der Kokain-induzierten Plastizität an diesen Synapsen das Kokain-motivierte Kokain-Suchverhalten reduzieren würde. Um diese Art der Neuromodulation in vivo zu erreichen, wollten wir eine synaptische Langzeitdepression (LTD) induzieren, die die Stärke der MGN-LA-Synapsen verringert. Zu diesem Zweck haben wir die Optogenetik verwendet, die die Neuromodulation von Gehirnschaltkreisen mit Hilfe von Licht ermöglicht. Das exzitatorische Opsin oChiEF wurde an präsynaptischen MGN-Terminals in der LA exprimiert, indem ein AAV, das oChiEF enthält, in das MGN infundiert wurde. Optische Fasern wurden dann in die LA implantiert und 473 nm Laserlicht wurde 15 Minuten lang mit einer Frequenz von 1 Hz gepulst, um LTD zu induzieren und die Kokain-induzierte Plastizität umzukehren. Diese Manipulation führt zu einer lang anhaltenden Verringerung der Fähigkeit von Reizen, die mit Kokain in Verbindung gebracht werden, Drogensuchaktionen zu induzieren.
Introduction
Drogenmissbrauch ist ein sehr ernstes Problem der öffentlichen Gesundheit in den USA und weltweit. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung gibt es nur sehr wenige wirksame Therapieoptionen 1,2. Ein großer Rückschlag für die Behandlung ist die Tatsache, dass chronischer Drogenkonsum langfristige assoziative Erinnerungen zwischen Umweltreizen und der Droge selbst erzeugt. Die erneute Exposition gegenüber drogenbezogenen Hinweisen führt zu physiologischen und Verhaltensreaktionen, die zu fortgesetztem Drogenkonsum und Rückfällen motivieren3. Eine neuartige therapeutische Strategie besteht darin, gedächtnisbasierte Behandlungen durchzuführen, die darauf abzielen, die Schaltkreise zu manipulieren, die an der Regulierung von Medikamenten-Cue-Assoziationen beteiligt sind. Kürzlich wurde beobachtet, dass Synapsen in der lateralen Amygdala (LA), insbesondere solche, die aus dem medialen Genikularkern (MGN) des Thalamus entstehen, durch wiederholte Cue-assoziierte Kokain-Selbstverabreichung verstärkt werden und dass diese Potenzierung das Kokainsuchverhalten unterstützen kann 4,5. Daher wurde vorgeschlagen, dass die Cue-induzierte Wiedereinsetzung durch Umkehrung der Plastizität an MGN-LA-Synapsen abgeschwächt werden könnte.
Die Fähigkeit, die synaptische Plastizität eines bestimmten Gehirnschaltkreises präzise zu steuern, war eine große Herausforderung für das Feld. Traditionelle pharmakologische Werkzeuge haben einige Erfolge bei der Verringerung des Rückfallverhaltens erzielt, sind jedoch durch die Unfähigkeit, einzelne Synapsen zu manipulieren, begrenzt. Die jüngste Entwicklung der In-vivo-Optogenetik hat jedoch die Werkzeuge zur Verfügung gestellt, die benötigt werden, um diese Einschränkungen zu überwinden und neuronale Bahnen mit zeitlicher und räumlicher Präzision zu kontrollieren 6,7,8. Durch die Expression von lichtempfindlichen Opsinen in einem bestimmten Gehirnschaltkreis kann Laserlicht dann verwendet werden, um den Schaltkreis zu aktivieren oder zu hemmen. Frequenzabhängige optische Stimulation kann genutzt werden, um die synaptische Plastizität des Schaltkreises in einem sich verhaltenden Tier gezielt zu manipulieren.
Dieses Manuskript skizziert das Verfahren zur Manipulation des verhaltensrelevanten MGN-LA-Schaltkreises mit Hilfe von In-vivo-Optogenetik . Zuerst wurde das exzitatorische Opsin oChIEF im MGN exprimiert und optische Fasern wurden bilateral in das LA implantiert. Die Tiere wurden dann darauf trainiert, Kokain in einer reizabhängigen Art und Weise selbst zu verabreichen, was den MGN-LA-Signalweg potenziert. Als nächstes wurde eine anhaltende, niederfrequente Stimulation mit 473 nm Laserlicht verwendet, um schaltungsspezifische LTD zu erzeugen. Die Umkehrung der durch Kokainkonsum induzierten Plastizität führte zu einer lang anhaltenden Verringerung der Fähigkeit von Reizen, Handlungen auszulösen, die mit Drogensuchverhalten verbunden sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie oben beschrieben, gibt es mehrere kritische Schritte, die wichtig sind, um die richtigen experimentellen Ergebnisse zu erzielen. Das Protokoll wird wahrscheinlich nur bei Tieren wirksam sein, die eine ordnungsgemäße Selbstverabreichung von Kokain erhalten, und bisher wurde es nur mit den oben genannten Parametern getestet. Es ist möglich, dass die Kokaindosis, das Verstärkungsschema und die Cue-Parameter mit wahrscheinlich geringen Auswirkungen auf die Verhaltensergebnisse modifiziert werden können, mit der Ausn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den USPHS-Zuschüssen K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) und dem Pennsylvania Department of Health.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
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