Использование оптогенетики для обращения вспять нейропластичности и ингибирования поиска кокаина у крыс
Summary
Методы, описанные здесь, описывают процедуру, используемую для оптогенетического обращения вспять пластичности, вызванной кокаином, в поведенчески значимой цепи у крыс. Устойчивая низкочастотная оптическая стимуляция таламо-миндалиновых синапсов вызывает длительную депрессию (ЛТД). In vivo оптогенетически индуцированная ЛТД у крыс, испытывающих кокаин, приводила к последующему ослаблению поиска наркотиков, мотивированных сигналами.
Abstract
Этот протокол демонстрирует шаги, необходимые для использования оптогенетических инструментов для обращения вспять пластичности, вызванной кокаином, в таламо-миндалиновых цепях, чтобы уменьшить последующее поведение крысы в поисках кокаина. В нашем исследовании мы обнаружили, что, когда крысы самостоятельно вводят внутривенный кокаин в сочетании с аудиовизуальным сигналом, синапсы, образующиеся на входах из медиального геникулярного ядра таламуса (MGN) на основные нейроны боковой миндалины (LA), становятся сильнее по мере изучения ассоциации сигнал-кокаин. Мы предположили, что изменение пластичности, вызванной кокаином, в этих синапсах уменьшит поведение, мотивированное кокаином. Чтобы выполнить этот тип нейромодуляции in vivo, мы хотели вызвать синаптическую долгосрочную депрессию (LTD), которая снижает силу синапсов MGN-LA. С этой целью мы использовали оптогенетику, которая позволяет нейромодуляцию мозговых цепей с помощью света. Возбуждающий опсин oChiEF экспрессировался на пресинаптических терминалях MGN в LA путем введения AAV, содержащего oChiEF, в MGN. Затем оптические волокна были имплантированы в ЛОС-Анджелес, и лазерный свет 473 нм был импульсным с частотой 1 Гц в течение 15 минут, чтобы индуцировать LTD и обратную пластичность, вызванную кокаином. Эта манипуляция приводит к длительному снижению способности сигналов, связанных с кокаином, побуждать к действиям по поиску наркотиков.
Introduction
Злоупотребление психоактивными веществами является очень серьезной проблемой общественного здравоохранения в США и во всем мире. Несмотря на десятилетия интенсивных исследований, существует очень мало эффективных терапевтических вариантов 1,2. Основным препятствием для лечения является тот факт, что хроническое употребление наркотиков порождает долгосрочные ассоциативные воспоминания между сигналами окружающей среды и самим препаратом. Повторное воздействие сигналов, связанных с наркотиками, приводит к физиологическим и поведенческим реакциям, которые мотивируют продолжение употребления наркотиков и рецидив3. Новая терапевтическая стратегия заключается в принятии методов лечения, основанных на памяти, которые направлены на манипулирование схемами, участвующими в регулировании ассоциаций между наркотиками и сигналами. Недавно было замечено, что синапсы в боковой миндалине (LA), особенно те, которые возникают из медиального геникулярного ядра (MGN) таламуса, усиливаются повторным самоприменением кокаина, связанным с сигналом, и что это потенцирование может поддерживать поведение, ищущее кокаин 4,5. Поэтому было высказано предположение о том, что вызванное сигналом восстановление может быть ослаблено путем обращения вспять пластичности в синапсах MGN-LA.
Способность точно нацеливаться на синаптическую пластичность конкретной мозговой цепи была серьезной проблемой для этой области. Традиционные фармакологические инструменты имели некоторый успех в снижении рецидивирующего поведения, но ограничены неспособностью манипулировать отдельными синапсами. Тем не менее, недавнее развитие оптогенетики in vivo предоставило инструменты, необходимые для преодоления этих ограничений и управления нейронными путями с временной и пространственной точностью 6,7,8. Экспрессируя светочувствительные опсины в определенной мозговой цепи, лазерный свет затем может быть использован для активации или ингибирования цепи. Частотно-зависимая оптическая стимуляция может быть использована для специального манипулирования синаптической пластичностью цепи у ведущего себя животного.
В этой рукописи описывается процедура, предпринятая для манипулирования поведенчески значимой схемой MGN-LA с использованием оптогенетики in vivo . Во-первых, возбуждающий опсин oChIEF экспрессировался в MGN, а оптические волокна были двусторонне имплантированы в LA. Затем животных обучали самостоятельному введению кокаина в зависимости от сигнала, что потенцирует путь MGN-LA. Затем устойчивая низкочастотная стимуляция лазерным светом 473 нм была использована для получения специфической схемы LTD. Обращение вспять пластичности, вызванной употреблением кокаина, привело к длительному снижению способности сигналов вызывать действия, связанные с поведением в поисках наркотиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как описано выше, существует несколько критических шагов, которые важны для достижения надлежащих экспериментальных результатов. Протокол, вероятно, будет эффективен только у животных, которые должным образом приобретают самостоятельное введение кокаина, и на сегодняшний день он был…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны грантов USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) и Департамента здравоохранения Пенсильвании.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
