オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する
Summary
ここで説明する方法は、ラットの行動関連回路におけるコカイン誘発可塑性を光遺伝学的に逆転させるために使用される手順を概説する。視床-扁桃体シナプスの持続的な低周波光刺激は、長期うつ病(LTD)を誘発します。コカインを経験したラットにおける in vivo 光遺伝学的に誘導されたLTDは、その後の手がかり動機による薬物探索の減弱をもたらした。
Abstract
このプロトコルは、視床-扁桃体回路でコカイン誘発性を逆転させ、ラットにおけるその後のコカイン探索行動を減らすために光遺伝学的ツールを使用するために必要なステップを示しています。私たちの研究では、ラットが視聴覚キューと組み合わせてコカインを静脈内投与すると、視床の内側膝状核(MGN)から外側扁桃体(LA)の主要なニューロンへの入力で形成されるシナプスが、キューとコカインの関連が学習されるにつれて強くなることがわかりました。これらのシナプスでのコカイン誘発可塑性の逆転は、合図動機によるコカイン探索行動を減少させるという仮説を立てた。このような神経調節を in vivoで実現するために、MGN-LAシナプスの強度を低下させるシナプス長期抑制(LTD)を誘導したいと考えました。この目的のために、私たちは光を使って脳回路の神経調節を可能にするオプトジェネティクスを使用しました。興奮性オプシンoChiEFは、oChiEFを含むAAVをMGNに注入することにより、LAのシナプス前MGN末端に発現しました。次に、光ファイバーをLAに埋め込み、473 nmのレーザー光を1 Hzの周波数で15分間パルスして、LTDと逆コカイン誘発可塑性を誘導しました。この操作は、薬物探索行動を誘発するコカインに関連する手がかりの能力の長期的な低下をもたらします。
Introduction
薬物乱用は、米国および世界中で非常に深刻な公衆衛生問題です。何十年にもわたる集中的な研究にもかかわらず、効果的な治療オプションはほとんどありません1,2。治療の大きな後退は、慢性的な薬物使用が環境手がかりと薬物自体との間に長期的な連想記憶を生成するという事実です。薬物関連の手がかりへの再曝露は、継続的な薬物使用と再発を動機付ける生理学的および行動的反応を促進します3。新しい治療戦略は、薬物と手がかりの関連を調節することに関与する回路を操作することを目的とした記憶ベースの治療法を制定することです。最近、外側扁桃体(LA)のシナプス、特に視床の内側生殖核(MGN)から生じるシナプスは、手がかりに関連するコカインの自己投与を繰り返すことによって強化され、この増強がコカイン探索行動をサポートできることが観察されました4,5。したがって、MGN-LAシナプスの可塑性を逆転させることで、キュー誘発による回復を減衰させることができると提案されました。
特定の脳回路のシナプス可塑性を正確に標的にする能力は、この分野にとって大きな課題でした。従来の薬理学的ツールは、再発行動を減少させることにある程度成功しているが、個々のシナプスを操作できないことによって制限されている。しかし、in vivoオプトジェネティクスの最近の開発は、これらの制限を克服し、時間的および空間的精度で神経経路を制御するために必要なツールを提供しました6,7,8。特定の脳回路で光感受性オプシンを発現させることにより、レーザー光を使用して回路を活性化または阻害することができます。周波数依存性光刺激は、行動する動物における回路のシナプス可塑性を特異的に操作するために利用することができる。
この原稿は、 in vivo オプトジェネティクスを使用して行動に関連するMGN-LA回路を操作するために取られた手順を概説します。まず、興奮性オプシンoChIEFをMGNで発現させ、光ファイバーをLAに両側に移植した。次に、動物は、MGN-LA経路を増強する手がかり依存的な方法でコカインを自己投与するように訓練されました。次に、473nmのレーザー光による持続的な低周波刺激を用いて、回路固有のLTDを製造した。 コカイン使用によって誘発される可塑性を逆転させることは、薬物探索行動に関連する行動を引き起こす手がかりの能力の長期的な低下をもたらした。
Protocol
このプロトコルに記載されている実験は、 実験動物の世話と使用のための 国立衛生研究所ガイドによって定められたガイドラインと一致しており、ピッツバーグ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、到着時の体重が275〜325 gの成体のナイーブなSprague-Dawleyラットを使用して実行されました。 1.光ファイバーインプラ…
Representative Results
実験の順序を概説するタイムラインを 図1に示します。行動実験を通して、コカイン注入の数とアクティブレバーで行われた反応の数は、コカイン探索行動の強度の尺度として機能します。コカインの自己投与の最初の数日間は、積極的な反応の数は、2週目に安定する前に、各獲得日にわたって徐々に増加するはずです。逆に、非アクティブなレバー応答は、実験全体?…
Discussion
上述したように、適切な実験結果を達成するために重要ないくつかの重要なステップがある。このプロトコルは、コカインの自己投与を適切に獲得した動物にのみ有効である可能性が高く、これまでのところ、上記で概説したパラメーターを使用してのみテストされています。コカインの投与量、強化のスケジュール、およびキューパラメータは、行動の結果にほとんど影響を与えずに変更?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、USPHS助成金K01DA031745(MMT)、R01DA042029(MMT)、DA035805(YHH)、F31DA039646(MTR)、T32031111(MTR)、およびペンシルベニア州保健省からの支援に感謝したいと思います。
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
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Cite This Article
Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats. J. Vis. Exp. (176), e63185, doi:10.3791/63185 (2021).