Bruk av optogenetikk for å reversere nevroplastisitet og hemme kokainsøking hos rotter
Summary
Metodene beskrevet her skisserer en prosedyre som brukes til å optogenetisk reversere kokainindusert plastisitet i en atferdsmessig relevant krets hos rotter. Vedvarende lavfrekvent optisk stimulering av thalamo-amygdala-synapser induserer langvarig depresjon (LTD). In vivo optogenetisk indusert LTD hos kokain-erfarne rotter resulterte i påfølgende demping av signalmotivert narkotikasøking.
Abstract
Denne protokollen viser trinnene som trengs for å bruke optogenetiske verktøy for å reversere kokainindusert plastisitet ved thalamo-amygdala-kretser for å redusere påfølgende kokainsøkende atferd hos rotter. I vår forskning hadde vi funnet ut at når rotter selvadministrerer intravenøs kokain parret med et audiovisuelt signal, blir synapser dannet ved innganger fra den mediale genikulate kjernen i thalamus (MGN) på hovedneuroner i lateral amygdala (LA) sterkere etter hvert som cue-kokainforeningen læres. Vi hadde en hypotese om at reversering av den kokaininduserte plastisiteten i disse synapsene ville redusere den kokainsøkende atferden. For å oppnå denne typen nevromodulering in vivo, ønsket vi å indusere synaptisk langvarig depresjon (LTD), noe som reduserer styrken til MGN-LA-synapser. Til dette formål brukte vi optogenetikk, som tillater nevromodulering av hjernekretser ved hjelp av lys. Den eksitatoriske opsin oChiEF ble uttrykt på presynaptiske MGN-terminaler i LA ved å infusere en AAV inneholdende oChiEF i MGN. Optiske fibre ble deretter implantert i LA og 473 nm laserlys ble pulsert med en frekvens på 1 Hz i 15 minutter for å indusere LTD og reversere kokainindusert plastisitet. Denne manipulasjonen fører til en langvarig reduksjon i evnen til signaler forbundet med kokain til å indusere narkotikasøkende handlinger.
Introduction
Stoffmisbruk er et svært alvorlig folkehelseproblem i USA og over hele verden. Til tross for flere tiår med intens forskning, er det svært få effektive terapeutiske alternativer 1,2. Et stort tilbakeslag for behandlingen er det faktum at kronisk narkotikabruk genererer langsiktige assosiative minner mellom miljømessige signaler og stoffet selv. Reeksponering for narkotikarelaterte signaler driver fysiologiske og atferdsmessige responser som motiverer fortsatt narkotikabruk og tilbakefall3. En ny terapeutisk strategi er å vedta minnebaserte behandlinger som tar sikte på å manipulere kretsene som er involvert i regulering av narkotika-cue-foreninger. Nylig ble det observert at synapser i lateral amygdala (LA), spesielt de som oppstår fra thalamus mediale geniculate nucleus (MGN), styrkes av gjentatt cue-assosiert kokain selvadministrasjon, og at denne potensieringen kan støtte kokainsøkende atferd 4,5. Derfor ble det foreslått at cue-indusert gjenoppretting kunne dempes ved å reversere plastisiteten ved MGN-LA-synapser.
Evnen til å presist målrette den synaptiske plastisiteten til en bestemt hjernekrets har vært en stor utfordring for feltet. Tradisjonelle farmakologiske verktøy har hatt en viss suksess i å redusere tilbakefallsatferd, men er begrenset av manglende evne til å manipulere individuelle synapser. Den nylige utviklingen av in vivo optogenetikk har imidlertid gitt verktøyene som trengs for å overvinne disse begrensningene og kontrollere nevrale veier med tidsmessig og romlig presisjon 6,7,8. Ved å uttrykke lysfølsomme opsiner i en bestemt hjernekrets, kan laserlys deretter brukes til å aktivere eller hemme kretsen. Frekvensavhengig optisk stimulering kan brukes til å spesifikt manipulere den synaptiske plastisiteten til kretsen i et dyr som oppfører seg.
Dette manuskriptet skisserer prosedyren som er tatt for å manipulere den atferdsmessig relevante MGN-LA-kretsen ved bruk av in vivo optogenetikk. Først ble eksitatorisk opsin oChIEF uttrykt i MGN og optiske fibre ble bilateralt implantert i LA. Dyr ble deretter trent til å selvadministrere kokain på en køavhengig måte, noe som forsterker MGN-LA-banen. Deretter ble vedvarende, lavfrekvent stimulering med 473 nm laserlys brukt til å produsere kretsspesifikk LTD. Reversering av plastisiteten indusert av kokainbruk genererte en langvarig reduksjon i signalenes evne til å utløse handlinger som er forbundet med narkotikasøkende atferd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som beskrevet ovenfor er det flere kritiske trinn som er viktige for å oppnå de riktige eksperimentelle resultatene. Protokollen vil sannsynligvis bare være effektiv hos dyr som får selvadministrasjon av kokain på riktig måte, og til dags dato har den bare blitt testet ved hjelp av parametrene som er skissert ovenfor. Det er mulig at kokaindosen, tidsplanen for forsterkning og signalparametrene kan modifiseres med sannsynligvis liten effekt på atferdsresultatene, med unntak av at en annenordens forsterkningsplan k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra USPHS tilskudd K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR), og Pennsylvania Department of Health.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
