Sous-culture et cryoconservation des organoïdes de l’adénocarcinome œsophagien: avantages et inconvénients de la digestion unicellulaire

Summary

Ce protocole décrit les méthodes de sous-culture et de cryoconservation des organoïdes de l’adénocarcinome de l’œsophage avec et sans digestion unicellulaire pour permettre aux chercheurs de choisir des stratégies appropriées en fonction de leur conception expérimentale.

Abstract

Le manque de modèles de recherche translationnelle appropriés reflétant la maladie primaire pour explorer la tumorigenèse et les stratégies thérapeutiques est un obstacle majeur dans l’adénocarcinome de l’œsophage (CAE). Les organoïdes dérivés du patient (AOP) sont récemment apparus comme un modèle préclinique remarquable dans une variété de cancers. Cependant, il existe encore peu de protocoles disponibles pour le développement des AOP EAC. Une fois les AOP établies, la propagation et la cryoconservation sont essentielles pour d’autres analyses en aval. Ici, deux méthodes différentes ont été normalisées pour la sous-culture et la cryoconservation des PDO EAC, c’est-à-dire avec et sans digestion unicellulaire. Les deux méthodes peuvent obtenir de manière fiable la viabilité cellulaire appropriée et sont applicables à une configuration expérimentale diversifiée. L’étude actuelle a démontré que la sous-culture des AOP EAC avec digestion unicellulaire convient à la plupart des expériences nécessitant un contrôle du nombre de cellules, une densité uniforme et une structure creuse qui facilite le suivi de la taille. Cependant, la méthode à base de cellules uniques montre une croissance plus lente en culture ainsi qu’après une nouvelle culture à partir de stocks congelés. En outre, la sous-culture avec digestion unicellulaire se caractérise par la formation de structures creuses avec un noyau creux. En revanche, le traitement des AOP EAC sans digestion unicellulaire est favorable à la cryoconservation, à l’expansion et à la caractérisation histologique. Dans ce protocole, les avantages et les inconvénients de la sous-culture et de la cryoconservation des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire sont décrits pour permettre aux chercheurs de choisir une méthode appropriée pour traiter et étudier leurs organoïdes.

Introduction

Le cancer de l’œsophage (EC) est la dixième cause de décès par cancer dans le monde¹. L’adénocarcinome de l’œsophage (CAE) est l’un des principaux sous-types histologiques de la CE et survient principalement dans les pays occidentaux². Au cours de la dernière décennie, l’incidence de la CAE a considérablement augmenté dans de nombreux pays développés, y compris en Allemagne³. En raison de l’agressivité du cancer et de l’absence de symptômes au stade précoce du développement de la tumeur, le pronostic global chez les patients atteints de CAE est mauvais, montrant un taux de survie à 5 ans d’environ 20%^2,4,5.

Depuis la fin du XXe siècle, plusieurs modèles ont été établis pour la recherche biomédicale de l’EAC. Les lignées cellulaires EAC humaines classiques qui ont été établies dans les années 1990⁶, étendent nos connaissances de la biologie tumorale EAC, de la génétique tumorale ainsi que des stratégies anti-tumorales, et sont couramment utilisées dans la recherche EAC. En outre, certains groupes de recherche ont développé avec succès des modèles animaux de l’EAC ou de l’œsophage de Barrett en exposant les animaux à des facteurs de risque connus tels que le reflux gastro-œsophagien par des approches chirurgicales ou inflammatoires ^7,8,9. En outre, des modèles de xénogreffe dérivés du patient (PDX) qui greffent des tissus cancéreux primaires EAC par voie sous-cutanée ou orthotopique dans des souris immunodéficientes, ont été développés pour simuler le comportement biologique de la tumeur EAC humaine et l’environnement tumoral 10,11,12. Cependant, malgré l’amélioration des applications cliniques et notre compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse et de la progression de l’EAC, il reste un défi majeur à relever pour extrapoler les résultats de ces modèles de recherche à l’homme.

Les organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDO) sont cultivés dans un système de culture 3D qui imite le développement humain et la régénération des organes in vitro. Générées à partir du tissu primaire des patients, les PDO récapitulent les caractéristiques moléculaires et phénotypiques de la tumeur humaine et ont montré des applications prometteuses dans le développement de médicaments et le traitement personnalisé du cancer^13,14. En comparant dix cas de PDO EAC avec leur tissu tumoral apparié, les PDO EAC partageraient des caractéristiques histopathologiques et un paysage génomique similaires avec la tumeur primaire, conserveraient l’hétérogénéité intra-tumorale et faciliteraient un dépistage efficace des médicaments in vitro¹⁵. Les PDO EAC ont également été utilisés dans l’étude de l’interaction des cellules tumorales EAC avec les fibroblastes associés au cancer (CAF) dérivés du patient, indiquant une application puissante dans le domaine de la recherche sur le microenvironnement tumoral¹⁶. Malheureusement, il y a eu peu de protocoles disponibles pour développer et propager des AOP EAC. Ici, deux méthodes différentes sont décrites en détail pour la sous-culture et la préservation des AOP EAC: avec et sans digestion unicellulaire. Les méthodes normalisées de maintenance des AOP du CAE et de leurs applications peuvent aider les chercheurs à choisir des méthodes appropriées à différentes fins dans leur recherche sur les AOP du CAE.

Protocol

Une culture d’AOP établie et en bonne croissance représente la base d’une sous-culture et d’une cryoconservation réussies décrites dans ce protocole. Ici, les PDO EAC ont été générés à partir du tissu tumoral primaire des patients EAC en utilisant le protocole décrit par Karakasheva T. A. et al17. Les tissus EAC ont été prélevés dans une biobanque sous l’approbation de BioMaSOTA (approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Cologne, ID: 13-091). <p class="…

Representative Results

Ce protocole présente les procédures, y compris la sous-culture et la cryoconservation des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire. La figure 1 montre des images représentatives de contraste de phase des deux stratégies de sous-culture différentes. Les AOP du CAE ont atteint une densité appropriée pour la sous-culture (figure 1, à gauche). La sous-culture sans digestion unicellulaire prend moins de temps pour atteindre un…

Discussion

Dans ce protocole, deux méthodes différentes de sous-culture et de cryoconservation des AOP EAC sont décrites, c’est-à-dire avec et sans digestion unicellulaire. Plusieurs études ont recommandé de passer les PDO EAC avec une digestion unicellulaire^15,17, ce qui est bénéfique pour la plupart des expériences qui nécessitent un contrôle du nombre de cellules, une densité uniforme et une structure creuse qui facilite le suivi de la taille. Cependant, la…

Materials

Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503