Subcultivo y criopreservación de organoides del adenocarcinoma esofágico: pros y contras para la digestión unicelular
Summary
Este protocolo describe los métodos de subcultivo y criopreservación de organoides del adenocarcinoma de esófago con y sin digestión unicelular para permitir a los investigadores elegir estrategias apropiadas basadas en su diseño experimental.
Abstract
La falta de modelos de investigación traslacional adecuados que reflejen la enfermedad primaria para explorar la tumorigénesis y las estrategias terapéuticas es un obstáculo importante en el adenocarcinoma de esófago (CAO). Los organoides derivados de pacientes (PDO) han surgido recientemente como un modelo preclínico notable en una variedad de cánceres. Sin embargo, todavía hay protocolos limitados disponibles para desarrollar DOP de EAC. Una vez que se establecen las DOP, la propagación y la criopreservación son esenciales para futuros análisis posteriores. Aquí, se han estandarizado dos métodos diferentes para el subcultivo y la criopreservación de las DOP EAC, es decir, con y sin digestión unicelular. Ambos métodos pueden obtener de manera confiable la viabilidad celular adecuada y son aplicables para una configuración experimental diversa. El estudio actual demostró que subcultivar las PDO de EAC con digestión de una sola célula es adecuado para la mayoría de los experimentos que requieren control del número de células, densidad uniforme y una estructura hueca que facilita el seguimiento del tamaño. Sin embargo, el método basado en una sola célula muestra un crecimiento más lento en el cultivo, así como después del recultivo de las poblaciones congeladas. Además, el subcultivo con digestión unicelular se caracteriza por formar estructuras huecas con un núcleo hueco. Por el contrario, el procesamiento de PDO de CAO sin digestión unicelular es favorable para la criopreservación, la expansión y la caracterización histológica. En este protocolo, se describen las ventajas y desventajas del subcultivo y la criopreservación de las DOP EAC con y sin digestión unicelular para permitir a los investigadores elegir un método apropiado para procesar e investigar sus organoides.
Introduction
El cáncer de esófago (CE) es la décima causa más común y la sexta causa de muerte por cáncer en todo el mundo1. El adenocarcinoma de esófago (CAO) es uno de los principales subtipos histológicos de la CE y se presenta principalmente en los países occidentales2. En la última década, la incidencia de la CAO ha aumentado significativamente en muchos países desarrollados, incluida Alemania3. Debido a la agresividad del cáncer y la falta de síntomas durante la etapa temprana del desarrollo del tumor, el pronóstico general en los pacientes con CAO es pobre, mostrando una tasa de supervivencia a 5 años de alrededor del 20%2,4,5.
Desde finales del siglo XX, se han establecido varios modelos para la investigación biomédica de la EAC. Las líneas celulares clásicas de EAC humanas que se establecieron en la década de 19906, amplían nuestro conocimiento de la biología tumoral de EAC, la genética tumoral y las estrategias antitumorales, y se utilizan comúnmente en la investigación de EAC. Además, algunos grupos de investigación han desarrollado con éxito modelos animales de EAC o esófago de Barrett al exponer a los animales a factores de riesgo conocidos como el reflujo gastroesofágico a través de enfoques quirúrgicos o inflamatorios 7,8,9. Además, se desarrollaron modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) que injertan tejidos de cáncer primario de EAC por vía subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes, para simular el comportamiento biológico del tumor EAC humano y el entorno tumoral 10,11,12. Sin embargo, a pesar de que estos modelos mejoran las aplicaciones clínicas y nuestra comprensión de los mecanismos moleculares detrás de la tumorigénesis y progresión de EAC, todavía existe un gran desafío para extrapolar los resultados de estos modelos de investigación a los humanos.
Los organoides tumorales derivados del paciente (PDO) se cultivan en un sistema de cultivo 3D que imita el desarrollo humano y la regeneración de órganos in vitro. Generadas a partir del tejido primario de los pacientes, las DOP recapitulan las características moleculares y fenotípicas del tumor humano y han mostrado aplicaciones prometedoras en el desarrollo de fármacos y el tratamiento personalizado del cáncer13,14. Al comparar diez casos de PDO de EAC con su tejido tumoral pareado, se informa que las PDO de EAC comparten características histopatológicas y un panorama genómico similares con el tumor primario, conservan la heterogeneidad intratumoral y facilitan el cribado farmacológico eficiente in vitro15. Los PDO de EAC también se utilizaron en el estudio de la interacción de las células tumorales de EAC con fibroblastos asociados al cáncer (CAF) derivados de pacientes, lo que indica una poderosa aplicación en el campo de la investigación del microambiente tumoral16. Desafortunadamente, ha habido protocolos limitados disponibles para desarrollar y propagar PDO de EAC. Aquí, se describen dos métodos diferentes para subculpir y preservar las DOP de LA CAO en detalle: con y sin digestión unicelular. Los métodos estandarizados para el mantenimiento de las DOP de EAC y sus aplicaciones pueden ayudar a los investigadores a elegir métodos apropiados para diferentes propósitos en su investigación de DOP de EAC.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describen dos métodos diferentes de subcultivo y criopreservación de las DOP de CAO, es decir, con y sin digestión unicelular. Varios estudios recomendaron pasar los PDO de EAC con digestión de una sola célula15,17, lo que es beneficioso para la mayoría de los experimentos que requieren control del número de células, densidad uniforme y una estructura hueca que facilita el seguimiento del tamaño. Sin embargo, el método basado en un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Köln Fortune Program/Facultad de Medicina de la Universidad de Colonia. Agradecemos la asistencia técnica de Susanne Neiss, Michaela Heitmann y Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan fue apoyado financieramente por el Consejo de Becas de Élite de Guangzhou (GESC). Los autores agradecen al Dr. Joshua D’Rozario por su ayuda en la edición lingüística.
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
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