Summary
يصف هذا البروتوكول طرق الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للمركبات العضوية المسببة لسرطان المريء الغدي مع أو بدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار الاستراتيجيات المناسبة بناء على تصميمهم التجريبي.
Abstract
يعد عدم وجود نماذج بحثية انتقالية مناسبة تعكس المرض الأولي لاستكشاف تكوين الأورام والاستراتيجيات العلاجية عقبة رئيسية في السرطان الغدي المريئي (EAC). ظهرت المواد العضوية المشتقة من المرضى (PDOs) مؤخرا كنموذج رائع قبل السريري في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان. ومع ذلك، لا تزال هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير منظمات تنمية نفط أفريقيا التابعة لمجموعة شرق أفريقيا. وبمجرد إنشاء مؤسسات تنمية نفط عمان، يصبح الانتشار والحفظ بالتبريد ضروريين لإجراء المزيد من التحليلات النهائية. هنا ، تم توحيد طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية وحفظ التبريد في EAC PDO ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن لكلتا الطريقتين الحصول على صلاحية مناسبة للخلية بشكل موثوق وقابلة للتطبيق على إعداد تجريبي متنوع. أظهرت الدراسة الحالية أن زراعة الباطن EAC PDOs مع هضم خلية واحدة مناسبة لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، والكثافة الموحدة ، وبنية جوفاء تسهل تتبع الحجم. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على خلية واحدة تظهر نموا أبطأ في الثقافة وكذلك بعد إعادة الزراعة من المخزونات المجمدة. إلى جانب ذلك ، يتميز التزريع الفرعي بهضم خلية واحدة بتشكيل هياكل مجوفة ذات نواة جوفاء. في المقابل ، فإن معالجة EAC PDOs دون هضم خلية واحدة مواتية للحفظ بالتبريد والتوسع والتوصيف النسيجي. في هذا البروتوكول ، يتم وصف مزايا وعيوب الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار طريقة مناسبة لمعالجة والتحقيق في المواد العضوية الخاصة بهم.
Introduction
سرطان المريء (EC) هو العاشر الأكثر شيوعا والسبب الرئيسي السادس للوفاة من السرطان في جميع أنحاء العالم1. السرطان الغدي المريئي (EAC) هو أحد الأنواع الفرعية النسيجية الرئيسية لل EC ويحدث بشكل رئيسي في البلدان الغربية2. في العقد الأخير ، زاد معدل الإصابة ب EAC بشكل كبير في العديد من البلدان المتقدمة ، بما في ذلك ألمانيا3. بسبب عدوانية السرطان وعدم وجود أعراض خلال المرحلة المبكرة من تطور الورم ، فإن التشخيص العام في مرضى EAC ضعيف ، حيث يظهر معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات حوالي 20٪ 2,4,5.
منذ أواخر القرن العشرين ، تم إنشاء العديد من النماذج للبحوث الطبية الحيوية في EAC. خطوط خلايا EAC البشرية الكلاسيكية التي تم إنشاؤها في 1990s6 ، توسع معرفتنا ببيولوجيا أورام EAC ، وعلم الوراثة للورم ، بالإضافة إلى استراتيجيات مكافحة الورم ، وتستخدم عادة في أبحاث EAC. إلى جانب ذلك ، نجحت بعض المجموعات البحثية في تطوير نماذج حيوانية من EAC أو مريء باريت عن طريق تعريض الحيوانات لعوامل الخطر المعروفة مثل الارتجاع المعدي المريئي من خلال الأساليب الجراحية أو الالتهابية 7,8,9. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض والتي تغرس أنسجة السرطان الأولية EAC تحت الجلد أو بشكل تقويمي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، لمحاكاة السلوك البيولوجي البشري لورم EAC وبيئة الورم 10،11،12. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه النماذج تعمل على تحسين التطبيقات السريرية وفهمنا للآليات الجزيئية وراء تكوين الأورام وتطورها في EAC ، لا يزال هناك تحد كبير لاستقراء النتائج من هذه النماذج البحثية للبشر.
تزرع المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) في نظام ثقافة 3D الذي يحاكي التنمية البشرية وتجديد الأعضاء في المختبر. تقوم PDOs المتولدة من الأنسجة الأولية للمرضى بتلخيص الخصائص الجزيئية والمظهرية للورم البشري وأظهرت تطبيقات واعدة في تطوير الأدوية وعلاج السرطان الشخصي13,14. ومن خلال مقارنة عشر حالات من منظمات تنمية نفط أفريقيا مع أنسجة الورم المقترنة بها، تفيد التقارير بأن هذه الحالات تشترك في سمات نسيجية مرضية مماثلة ومشهد جينومي مع الورم الأساسي، وتحتفظ بعدم التجانس داخل الورم وتسهل الفحص الفعال للأدوية في المختبر15. كما تم استخدام منظمات تنمية نفط أفريقيا في دراسة تفاعل الخلايا السرطانية التابعة ل EAC مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) المشتقة من المريض ، مما يشير إلى وجود تطبيق قوي في مجال أبحاث البيئة الدقيقة للورم16. لسوء الحظ ، كانت هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير ونشر منظمات تنمية نفط EAC. هنا ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفاظ على PDOs EAC بالتفصيل: مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن للطرق الموحدة لصيانة منظمات تنمية نفط أفريقيا وتطبيقاتها أن تدعم الباحثين لاختيار الأساليب المناسبة لأغراض مختلفة في أبحاثهم الخاصة بشركة تنمية نفط أفريقيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمثل ثقافة شركة تنمية نفط عمان الراسخة والمتنامية جيدا الأساس لنجاح الثقافة الفرعية والحفظ بالتبريد الموصوف في هذا البروتوكول. هنا ، تم إنشاء EAC PDOs من أنسجة الورم الأولية لمرضى EAC باستخدام البروتوكول الذي وصفه Karakasheva T. A. et al17. تم جمع أنسجة EAC من البنك الحيوي بموجب موافقة BioMaSOTA (وافقت عليها لجنة الأخلاقيات بجامعة كولونيا ، ID: 13-091).
ملاحظة: تم استزراع شركات تنمية نفط عمان التابعة لشركة EAC في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 باستخدام وسيط استزراع شركة تنمية نفط عمان (الجدول 1). في الخطوات التالية ، يتم وصف طريقتين للثقافة الفرعية بالتفصيل. يوصى باستخدام صفيحة من 12 بئرا لزراعة برادو بكثافة بذر تبلغ ثلاث قباب هلامية مصفوفة خارج الخلية (ECM) لكل بئر ، لأنها تسمح بالاستخدام المرن لكل بئر وكمية مناسبة من PDOs لأغراض مختلفة. تقنية التعقيم إلزامية أثناء التعامل مع شركات تنمية نفط عمان.
1. التحضيرات مقدما
- قم بتسخين صفيحة من 12 بئرا مسبقا عن طريق وضعها في حاضنة CO2 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل الزراعة الفرعية لضمان الاحترار الكامل للصفيحة. إذا كان ذلك متاحا، استخدم الآبار الفارغة من طبق مع ثقافة شركة تنمية نفط عمان الحالية.
ملاحظة: يوصى بالتخزين المستمر ل 1-2 ألواح طازجة عند 37 درجة مئوية للتخطيط المرن للزراعة الفرعية. - قم بتبريد 1000 ميكرولتر و 200 ميكرولتر مسبقا مع فتحة واسعة عند -20 درجة مئوية (يوصى بالتخزين المستمر). جهاز طرد مركزي بارد مسبقا عند 4 درجات مئوية.
- قم بإعداد درجة حرارة الحاضنة الدوارة إلى 37 درجة مئوية (إذا تم إجراء عملية هضم خلية واحدة).
- احتضان كمية مناسبة من هلام ECM لمدة 1 ساعة على الجليد لتسييلها. ضع محلول استعادة الخلية على الجليد.
2. حصاد المواد العضوية
- قم بإزالة اللوحة مع شركات تنمية نفط عمان المتنامية من حاضنة CO2.
- شفط الوسط القديم باستخدام مضخة تفريغ.
ملاحظة: تجنب لمس القباب. - أضف كمية مناسبة من محلول استعادة الخلايا الباردة (500 ميكرولتر / قبة) إلى البئر.
- قم بتفكيك هلام ECM عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت قباب هلام ECM إلى قطع صغيرة باستخدام أطراف 1000 ميكرولتر مع فتحة واسعة.
- امزج خليط من PDO وهلام ECM ومحلول استعادة الخلايا من بئرين كحد أقصى (ست قباب) وانقله إلى أنبوب منخفض الربط سعة 5 مل (استخدم أنبوبا ثانيا في حالة استخدام المزيد من الآبار للزراعة الفرعية).
ملاحظة: اختياريا، إذا لم يتم إذابة هلام ECM بالكامل، أضف 1.5 مل إضافية من محلول استعادة الخلايا إلى خليط من PDO وهلام ECM ومحلول استرداد الخلايا. - احتضن الأنبوب الذي يحتوي على الخليط في الخطوة 2.5 على الثلج لمدة 20 دقيقة ، واخلطه كل 5 دقائق عن طريق عكس الأنبوب خمس مرات لضمان تسييل هلام ECM.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- إذا كانت هناك حبيبة مرئية ومستقرة بعد الطرد المركزي ، فتابع الخطوة 2.10. وإلا، فتابع إلى الخطوة 2.9.
- إذا لم يكن هناك حبيبات مرئية ولا تزال PDOs عالقة في مرحلة هلام ، فقم بإزالة supernatant بعناية باستخدام مضخة تفريغ حتى يتم الوصول إلى المرحلة التي تحتوي على ECM gel-PDO-Solution وإضافة 3 مل من محلول استعادة الخلايا الباردة الثلجية.
- اقلب الأنبوب عدة مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق أخرى. اخلط عن طريق عكس الأنبوب من وقت لآخر.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية واستمر في الخطوة 2.10.
- تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر. حاول إزالة supernatant قدر الإمكان.
ملاحظة: نظرا لانخفاض سطح الربط للأنبوب ، لن تكون الكريات مستقرة كالمعتاد. - قم بتخزين حبيبات شركة تنمية نفط عمان على الجليد وتابع الخطوة 3 (بدون هضم) أو الخطوة 4 (مع هضم خلية واحدة) اعتمادا على الأغراض المختلفة.
3. الزراعة الفرعية دون هضم
ملاحظة: تهدف هذه الطريقة إلى زيادة حجم وكثافة شركات تنمية نفط عمان. يسهل الحجم الأكبر والكثافة العالية عملية التضمين والتوصيف النسيجي وتوسيع شركة تنمية نفط عمان. اعتمادا على نسب تقسيم شركة تنمية نفط عمان (بناء على كثافة شركات تنمية نفط عمان، يوصى بنسبة تتراوح بين 1:3 و 1:6)، أعد تعليق الكريات من الخطوة 2.8 في حجم مناسب من هلام ECM السائل.
- قم بإزالة أطراف 200 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر المبردة مسبقا باستخدام فتحة واسعة من الفريزر -20 درجة مئوية وضعها على مقعد نظيف.
- أعد تعليق الكريات من الخطوة 2.11 في هلام ECM باستخدام أطراف 1000 ميكرولتر مبردة مسبقا. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات للتأكد من أن شركات تنمية نفط عمان لا تتكتل ويتم توزيعها بالتساوي في هلام ECM.
ملاحظة: استخدم 50 ميكرولتر ECM gel/dome. احسب دائما لقبة واحدة أكثر من المطلوب (على سبيل المثال ، لتسع قباب (أي ثلاثة آبار) ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من هلام ECM السائل (450 + 50 ميكرولتر إضافي). حاول تجنب إنتاج فقاعات أثناء إعادة التعليق! - قم بإزالة الصفيحة ذات ال 12 بئرا التي تم تسخينها مسبقا من الحاضنة مباشرة قبل بذر القباب.
- قباب البذور التي تحتوي على 50 ميكرولتر من هلام ECM في الصفيحة الدافئة (ثلاث قباب / بئر). تجنب سحب الفقاعات إلى قباب هلام ECM.
- ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2واحتضنها لمدة 20-30 دقيقة لتصلب هلام ECM.
- أضف وسيط شركة تنمية نفط عمان المسخن مسبقا (الجدول 1) بعناية دون إزعاج القباب.
- استزرع مؤسسات تنمية نفط عمان لمدة 7-14 يوما حتى تحدث الكثافة والمورفولوجيا المطلوبة.
4. الزراعة الفرعية مع هضم خلية واحدة
ملاحظة: تهدف الخطوات التالية إلى زيادة عدد شركات تنمية نفط عمان لكل قبة. يسهل هضم الخلية الواحدة التحكم في عدد الخلايا وتوسيع شركة تنمية نفط عمان.
- تحضير وسط الهضم عن طريق خلط 2 مل من 0.25 ٪ من التربسين-EDTA و 20 ميكرولتر DNase I (لهضم ثلاث قباب).
- أعد تعليق الكريات من الخطوة 2.11 بحجم مناسب من Trypsin-EDTA + DNase I المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ واخلطها حوالي 10 مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (استخدم نصائح 1000 ميكرولتر العادية).
- احتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة دوارة بسرعة دوران لا تقل عن 28 دورة في الدقيقة.
- قم بإعداد أنبوب 15 مل يحتوي على 6 مل من محلول مثبطات التربسين لفول الصويا (STI ، الجدول 2) (لكل 2 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA).
- بعد الهضم، امزج منظمات تنمية نفط عمان المهضومة جيدا عدة مرات مع ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتعطيل منظمات تنمية نفط عمان.
- انقل PDOs المهضومة إلى أنبوب 15 مل يحتوي على محلول STI لوقف عملية الهضم.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر. أعد تعليق الكريات في 1 مل من الوسط القاعدي (الجدول 3).
- تحديد تركيز الخلية وقابليتها للحياة باستخدام عداد خلية آلي أو مقياس دم.
- هضمت البذور شركة تنمية نفط عمان في صفيحة من 12 بئرا مع 2 × 104 خلايا لكل قبة.
- احسب رقم الخلية وفقا للقباب المخطط لها للبذر وانقلها إلى أنبوب ربط منخفض 1.5 مل جديد.
ملاحظة: احسب لقبة واحدة أكثر (+ 2 × 104 خلايا إضافية). على سبيل المثال ، لبذر ثلاث قباب في بئر واحد ، خذ 8 × 10 4 (2 × 10 4 * 3 + 2 × 104 إضافية) خلايا. - جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- في حالة عدم وجود بيليه مرئي ، تذكر اتجاه الأنبوب داخل جهاز الطرد المركزي لمعرفة مكان وجود الكرية.
- تخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. قم بإزالة supernatant قدر الإمكان دون إزعاج الكريات.
- أضف الحجم المناسب من هلام ECM إلى الكريات باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف فتحة عريضة 1000 ميكرولتر مبرد مسبقا (50 ميكرولتر / قبة + 50 ميكرولتر إضافي).
- اتبع الخطوات من 3.3 إلى 3.7.
- احسب رقم الخلية وفقا للقباب المخطط لها للبذر وانقلها إلى أنبوب ربط منخفض 1.5 مل جديد.
5. الحفظ بالتبريد لمنظمات تنمية نفط عمان المهضومة وغير المهضومة
ملاحظة: تعتبر منظمات تنمية نفط عمان المهضومة وغير المهضومة ذات الخلية الواحدة مناسبة لإعداد المخزونات الاحتياطية المجمدة. لاحظ أن شركة تنمية نفط عمان المعاد زراعتها من المخزونات المجمدة ذات الخلية الواحدة تتطلب وقتا أطول للتعافي والوصول إلى حجم معين.
- الحفظ بالتبريد لمنظمات تنمية نفط عمان غير المهضومة.
- ابدأ عملية الحفظ بالتبريد باستخدام الكريات من الخطوة 2.8. استخدم 500 ميكرولتر من وسط التجميد البارد لإعادة تعليق الكريات ونقلها إلى قارورة مبردة.
ملاحظة: تخزين قبتين لكل قارورة. - قم بتجميد PDOs بين عشية وضحاها في ثلاجة -80 درجة مئوية باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة.
- ابدأ عملية الحفظ بالتبريد باستخدام الكريات من الخطوة 2.8. استخدم 500 ميكرولتر من وسط التجميد البارد لإعادة تعليق الكريات ونقلها إلى قارورة مبردة.
- الحفظ بالتبريد ل PDOs المهضومة ذات الخلية الواحدة
- بعد حصاد وهضم PDOs ، ابدأ الحفظ بالتبريد من الخطوة 4.8.
- لتخزين قارورة واحدة مبردة ، انقل 4-5 × 10 5 خلايا إلى أنبوب ربط منخفض1.5 مل جديد.
ملاحظة: تخزين ثلاث قباب / قارورة. - جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. قم بإزالة supernatant قدر الإمكان دون إزعاج الكريات.
- أعد تعليق الكريات في حجم مناسب من وسط التجميد (500 ميكرولتر / قارورة) وانقلها إلى قارورة مبردة.
- قم بتجميد PDOs بين عشية وضحاها في ثلاجة -80 درجة مئوية باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة ونقلها إلى فريزر -150 درجة مئوية أو النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقدم هذا البروتوكول الإجراءات بما في ذلك الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة.
ويبين الشكل 1 صورا تمثيلية لتباين الطور لاستراتيجيتي الثقافة الفرعية المختلفتين. وصلت شركات تنمية نفط أفريقيا إلى الكثافة المناسبة للزراعة الفرعية (الشكل 1، إلى اليسار). يستغرق التزريع الفرعي بدون هضم خلية واحدة وقتا أقل للوصول إلى كثافة مماثلة ويؤدي بشكل أساسي إلى هياكل مدمجة (الشكل 1 ، الصف العلوي). وعلى النقيض من ذلك، تظهر منظمات تنمية نفط عمان المهضومة ذات الخلية الواحدة هياكل مجوفة ذات نواة مجوفة (الشكل 1، الصف السفلي). يوضح الشكل 2 تلطيخ الهيماتوكسيلين - إيوسين (H & E) وتلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) لشركات تنمية نفط الجنوب التابعة ل EAC المضمنة بالبارافين ذات الهياكل المدمجة والمجوفة. يتيح Pan-cytokeratin (Pan-CK) تحديد الخلايا السرطانية الظهارية18. يسلط السيتوكيراتين 7 (CK7) الضوء على الخلايا السرطانية الغدية المتمايزة19. توجد البنية المدمجة (الصف العلوي) في الغالب في الثقافة غير المهضومة ، في حين أن البنية المجوفة (الصف السفلي) هي المهيمنة في الثقافة التي خضعت لعملية هضم خلية واحدة.
يوضح الشكل 3 تلطيخ التألق المناعي (IHC) لأنسجة EAC المقترنة و PDOs ذات البنية المدمجة والبنية المجوفة. يسلط Ki67 الضوء على مجموعات الخلايا ذات الانتشار الخلوي الأعلى20. تم توزيع Ki67 (الأحمر) و Pan-CK (الأخضر) بالمثل بين الأنسجة الأولية EAC ، والهيكل المضغوط لشركة EAC PDO ، والهيكل المجوف لشركة EAC PDO. ويبين الشكل 4 الخصائص المورفولوجية لمنظمات تنمية نفط عمان التابعة لجماعة شرق أفريقيا في اليوم الأول من الاسترداد من المخزون المجمد باستخدام الحفظ بالتبريد القائم على خلية واحدة (يسار) والحفظ بالتبريد القائم على أساس منظمة تنمية نفط عمان غير المهضوم (يمين).
يلخص الشكل 5 مخططا انسيابيا لعملية الزراعة الفرعية ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة. باختصار ، فإن شركة تنمية نفط عمان EAC المتنامية بشكل جيد جاهزة للتمرير. تم حصاد وتكوير شركات تنمية نفط أفريقيا وتكويرها. بالنسبة لهضم الخلية الواحدة، تم هضم PDOs إنزيميا لمدة 5-10 دقائق للحصول على خلايا مفردة، والتي من المرجح أن تنمو لتصبح هياكل مجوفة تسهل التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا، والكثافة الموحدة، وتتبع الحجم. وبالنسبة للزراعة الفرعية غير المهضومة، تم تقسيم شركات تنمية نفط عمان للحصول على مساحة أكبر متنامية دون تعطيل إنزيمي، والتي من المرجح أن تنمو لتصبح هياكل مدمجة تسهل التحليلات النسيجية، والتوسع السريع، والانتعاش الأسرع من الحفظ بالتبريد.
الشكل 1: الخصائص المورفولوجية للزراعة الفرعية التابعة لشركة EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة تحت مجهر تباين الطور. تنمو شركات تنمية نفط أفريقيا إلى كثافة معينة قبل الزراعة الفرعية (يسار). عند الاستزراع الفرعي ل EAC PDOs دون هضم خلية واحدة ، تنمو PDOs تدريجيا من الهياكل المجوفة إلى الهياكل المدمجة (اليمين ، الصف العلوي) ، في حين أن PDOs المزروعة من خلايا مفردة تظهر في الغالب هياكل مجوفة (اليمين ، الصف السفلي). تم التقاط الصور باستخدام المجهر الضوئي المقلوب باستخدام هدف 5x. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخصائص النسيجية للهيكل المضغوط والبنية المجوفة لشركات تنمية نفط أفريقيا التابعة لشركة EAC. تلطيخ H&E (يسار) ، تلطيخ Pan-CK (وسط) ، وتلطيخ CK7 (يمين) للهيكل المدمج (الصف العلوي) والهيكل المجوف (الصف السفلي). تم التقاط الصور باستخدام المجهر الضوئي المقلوب باستخدام هدف 20x. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية لأنسجة EAC المقترنة و PDOs. تلطيخ التألق المناعي (IF) لأنسجة EAC المقترنة (الصف العلوي) ، والبنية المدمجة (الصف الأوسط) والبنية المجوفة (الصف السفلي) مع Pan-CK (الأخضر) ، Ki67 (الأحمر) ، و DAPI (الأزرق). تم التقاط الصور باستخدام مجهر التألق الآلي المقلوب باستخدام هدف 20x. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الخصائص المورفولوجية لمنظمات تنمية نفط أفريقيا التابعة لمجموعة شرق أفريقيا في اليوم الأول من الاسترداد من المخزون المجمد. صور تباين الطور لإعادة الزراعة من الحفظ بالتبريد القائم على خلية واحدة (يسار) والحفظ بالتبريد غير المهضوم القائم على شركة تنمية نفط عمان (يمين) في اليوم الأول من التعافي. تم التقاط الصور باستخدام المجهر الضوئي المقلوب باستخدام هدف 5x. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مخطط التدفق لعملية الزراعة الفرعية ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة.
| رصيد | التركيز النهائي | 50 مل | |||
| الوسط القاعدي (انظر الجدول 3) | 24 مل | ||||
| Wnt-3A وسط مشروط | 12 مل | ||||
| R-Spondin1 وسط مشروط من خلايا Cultrex R-Spondin | 12 مل | ||||
| ن-2 | 100x | 1x | 500 ميكرولتر | ||
| ب-27 | 50x | 1x | 1 مل | ||
| N-أسيتيل سيستئين | 0.5 م | 1 مللي متر | 100 ميكرولتر | ||
| شير-99021 | 5 مللي متر | 0.5 ميكرومتر | 5 ميكرولتر | ||
| عامل نمو البشرة البشرية المؤتلف (EGF) | 100 ميكروغرام/مل | 250 نانوغرام/مل | 125 ميكرولتر | ||
| A83-01 | 25 مللي متر | 0.5 ميكرومتر | 1 ميكرولتر | ||
| SB202190 | 10 مللي متر | 1 ميكرومتر | 5 ميكرولتر | ||
| غاسترين | 100 ميكرومتر | 0.1 ميكرومتر | 50 ميكرولتر | ||
| نيكوتيناميد | 1 م | 20 ميكرومتر | 1 مل | ||
| الجنتاميسين | 50 ملغم/مل | 10 ميكرومتر | 5 ميكرولتر | ||
| البنسلين / الستربتومايسين | 100x | 1x | 500 ميكرولتر | ||
| الأمفوتريسين ب | 250 ميكروغرام/مل | 0.60% | 300 ميكرولتر | ||
| أضيفي طازجة إلى البئر: | |||||
| راس | 100 ميكروغرام/مل | 50 ميكرولتر | |||
| Y-27632 | 10.5 ملليمتر | 50 ميكرولتر | |||
| تضاف عند إنشاء شركات تنمية نفط عمان جديدة من الأنسجة الأولية أو التعافي من المخزونات المجمدة | |||||
| FGF-10a | 100 ميكروغرام/مل | 100 نانوغرام/مل | 50 ميكرولتر | ||
الجدول 1: إعداد الوسط الثقافي لشركة تنمية نفط عمان التابعة لشركة شرق أفريقيا.
| مثبطات التربسين فول الصويا (STI) | 12.5 ملغ |
| اضبط على 50 مل مع DPBS | |
| تصفية من خلال فلتر معقم 0.2 ميكرومتر |
الجدول 2: تحضير محلول مثبطات التربسين لفول الصويا (STI).
| الكاشف | حجم | التركيز النهائي |
| DMEM / F-12 المتقدم | 48.2 مل | |
| هيبس (1 م) | 500 ميكرولتر | 10 مللي متر |
| إل-جلوتامين (100X) | 500 ميكرولتر | 1X |
| البنسلين الستربتومايسين (100X) | 500 ميكرولتر | 1X |
| الأمفوتريسين ب | 300 ميكرولتر | 0.60% |
| جنتاميسين (50 ملغم/مل) | 5 ميكرولتر | 5 ميكروغرام/مل |
الجدول 3: تحضير الوسط القاعدي.
| هضم خلية واحدة | |
| الايجابيات | سلبيات |
| التحكم في رقم الخلية | هشة أثناء التضمين |
| التحقق من الجدوى | الحاجة إلى وقت أطول بين المقاطع |
| ينطبق على سبيل المثال ، فحص المخدرات ، قياس التدفق الخلوي | وقت أطول للتعافي من المخزونات المجمدة |
| بدون هضم خلية واحدة | |
| الايجابيات | سلبيات |
| المورفولوجيا مفيدة للتحليلات النسيجية | التوسع في عدد شركات تنمية نفط عمان أكبر حجما من حيث العدد |
| استقرار أعلى في عملية التضمين | لا ينطبق على التحليلات التي يكون فيها تعليق الخلية الواحدة إلزاميا |
| التعافي السريع من المخزونات المجمدة | عدم التحكم في عدد الخلايا وتتبع الحجم |
الجدول 4: إيجابيات وسلبيات التثاقف الفرعي ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. أوصت العديد من الدراسات بتمرير PDOs EAC مع هضم خلية واحدة15,17 ، وهو أمر مفيد لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، وكثافة موحدة ، وبنية مجوفة تسهل تتبع الحجم. ومع ذلك ، تتميز الطريقة القائمة على الخلية الواحدة بنمو أبطأ بعد إعادة الزراعة من المخزونات المجمدة ومورفولوجيا أقل إحكاما خلال فترة الاستزراع. تشير التجربة إلى 2-3 أسابيع لإعادة الزراعة القائمة على خلية واحدة للوصول إلى الكثافة القابلة للتطبيق لعملية الاستزراع الفرعي. في المقابل ، يمكن أن تصل PDOs المجمدة EAC بدون هضم خلية واحدة إلى نفس الحجم في فترة أقصر (حوالي 1 أسبوع) بعد إعادة الزراعة. يمكن أن يكون أحد الأسباب هو الإجهاد الإضافي الناتج عن هضم التربسين لفترة طويلة نسبيا (10 دقائق). لذلك ، يوصى بالحفاظ على PDOs EAC غير المهضومة بنسبة 1: 1.5 (تجميد قبتين من PDOs EAC غير المهضومة والبذر مرة أخرى في ثلاث قباب لإعادة الزراعة). بالإضافة إلى ذلك، يوصى باستخدام منظمات تنمية نفط عمان غير المهضومة من EAC للتوسع السريع والتوصيف النسيجي بواسطة تلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية أو IF بسبب الهيكل المدمج. ويلخص الجدول 4 إيجابيات وسلبيات طريقتي الزراعة الفرعية.
تتطلب العديد من الخطوات الحاسمة الاهتمام في هذا البروتوكول. أولا، يجب تسخين ألواح زراعة شركة تنمية نفط عمان مسبقا بين عشية وضحاها في حاضنة تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية لضمان عملية تصلب قباب هلام ECM الطازجة. يوصى باستخدام صفيحة ساخنة للحفاظ على اللوحة عند 37 درجة مئوية أثناء التعامل مع مدة البذر الطويلة. ثانيا ، هناك حاجة إلى أنابيب ربط منخفضة أثناء عملية الزراعة الفرعية لتجنب خسارة كبيرة لشركة تنمية نفط عمان. لمنع فقدان هلام ECM ، يمكن تبريد الأطراف ذات فتحة التجويف الواسعة مسبقا في الفريزر -20 درجة مئوية قبل الاستخدام. هنا ، يتجنب الفتح الواسع للنصائح تلف هياكل شركة تنمية نفط عمان أثناء خطوة الحصاد. بعد ذلك ، يوصى باحتضان PDOs لمدة 20 دقيقة على الجليد قبل خطوة الطرد المركزي الأولى ، لضمان التسييل الكامل لهلام ECM. لاحظ أنه يجب ضبط جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية أثناء خطوات الطرد المركزي للحفاظ على هلام ECM المتبقي في الحالة السائلة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لطريقة الخلية الواحدة ، يوصى بخلط PDOs جيدا بعد حضانة التربسين باستخدام طرف طبيعي 1000 ميكرولتر لكسر كتل الخلايا قبل إضافة الأمراض المنقولة جنسيا ، بدلا من تصفية تعليق الخلية مباشرة باستخدام مصافي الخلايا ، لتجنب فقدان الخلايا.
يمكن إجراء بعض التعديلات في هذا البروتوكول. يمكن استبدال محلول استعادة الخلايا ب DPBS البارد المثلج لإذابة هلام ECM في خطوة الحصاد. ومع ذلك ، أظهرت التجارب قدرة أفضل على إذابة هلام ECM باستخدام محلول استعادة الخلايا. لذلك ، يوصى باستخدام DPBS البارد فقط كطريقة احتياطية بديلة. إذا لم يكن المختبر مجهزا بحاضنة دوارة ، فيمكن احتضان شركات تنمية نفط EAC بالتريبسين في حمام مائي 37 درجة مئوية إلى جانب الخلط عن طريق عكس الأنبوب كل 2-3 دقائق ، ويمكن استخدام 10٪ DMSO مع مصل البقر الجنيني (FBS) كبديل لوسط التجميد لإعداد مخزونات شركة تنمية نفط عمان المجمدة. ومع ذلك، يفضل استخدام وسط تجميد تجاري مع مصل أقل أو بدون مصل بسبب تحسن تعافي شركة تنمية نفط عمان.
ويلزم تناول بعض القيود في هذا البروتوكول. وبما أن هذه الطرق لم يتم اختبارها إلا في شركات تنمية نفط أفريقيا التابعة لمجموعة شرق أفريقيا، فإن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع أخرى من شركات تنمية نفط عمان غير واضح. على الرغم من أن إجراءات تمرير PDOs مع أو بدون هضم خلية واحدة موحدة لمعظم أنواع المواد العضوية21,22 ، لا تزال هناك حاجة لمحاولة البروتوكولات الحالية على أنواع السرطان الأخرى لضمان قابلية التكاثر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤدي حضانة التربسين لمدة 10 دقائق بنسبة 0.25٪ إلى إجهاد الخلايا أثناء الهضم. لذلك ، يمكن أن يختلف وقت الحضانة بناء على حالة شركة تنمية نفط عمان قبل الثقافة الفرعية وتنوع شركة تنمية نفط عمان الفردي. خلال المحاولات المبكرة، يقترح تعيين أوقات مختلفة لحضانة التربسين لكل شركة تنمية نفط شرق أفريقيا.
في الختام ، هذا هو البروتوكول الأول الذي يصف ويناقش الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن تطبيق زراعة الباطن في EAC PDOs مع هضم خلية واحدة على تجارب المقارنة بين المجموعات في حين أن PDOs EAC غير المهضومة مفيدة للتوصيف النسيجي والحفظ بالتبريد والتوسع السريع. هنا ، يتم توحيد الصيانة الروتينية ل EAC PDOs ، مما يوفر دليلا للباحثين لاختيار الطرق المناسبة لتوليد EAC العضوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح في هذا العمل.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج كولن فورتشن / كلية الطب ، جامعة كولونيا. ونشكر المساعدة التقنية المقدمة من سوزان نيس وميكايلا هايتمان وأنكي ويناند - دورفيلر. تم دعم Ningbo Fan ماليا من قبل مجلس قوانغتشو للمنح الدراسية للنخبة (GESC). يشكر المؤلفون الدكتور جوشوا دي روزاريو على مساعدته في التحرير اللغوي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -H., Lagergren, J.
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P.
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), Albany NY. 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B.
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
