यह प्रोटोकॉल उपसंस्कृति के तरीकों का वर्णन करता है और एसोफेजेल एडेनोकार्सिनोमा ऑर्गेनोइड्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के साथ और एकल सेल पाचन के बिना शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर उपयुक्त रणनीतियों को चुनने में सक्षम बनाता है।
उपयुक्त ट्रांसलेशनल अनुसंधान मॉडल की कमी प्राथमिक बीमारी को प्रतिबिंबित करने के लिए प्राथमिक बीमारी को प्रतिबिंबित करने के लिए एसोफैगल एडेनोकार्सिनोमा (ईएसी) में एक बड़ी बाधा है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) हाल ही में विभिन्न प्रकार के कैंसर में एक उल्लेखनीय प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में उभरे हैं। हालांकि, ईएसी पीडो विकसित करने के लिए अभी भी सीमित प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। एक बार पीडीओ स्थापित होने के बाद, प्रसार और क्रायोप्रिजर्वेशन आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं। यहां, ईएसी पीडो उपसंस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए दो अलग-अलग तरीकों को मानकीकृत किया गया है, यानी, एकल सेल पाचन के साथ और बिना। दोनों विधियां मज़बूती से उचित सेल व्यवहार्यता प्राप्त कर सकती हैं और एक विविध प्रयोगात्मक सेटअप के लिए लागू होती हैं। वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि एकल सेल पाचन के साथ EAC PDOs subculturing सेल संख्या नियंत्रण, समान घनत्व, और एक खोखली संरचना की आवश्यकता वाले अधिकांश प्रयोगों के लिए उपयुक्त है जो आकार ट्रैकिंग की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, एकल सेल-आधारित विधि संस्कृति में धीमी वृद्धि के साथ-साथ जमे हुए स्टॉक से फिर से खेती के बाद भी दिखाती है। इसके अलावा, एकल कोशिका पाचन के साथ subculturing एक खोखले कोर के साथ खोखले संरचनाओं के गठन की विशेषता है। इसके विपरीत, एकल सेल पाचन के बिना ईएसी पीडीओ को संसाधित करना क्रायोप्रिजर्वेशन, विस्तार और हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है। इस प्रोटोकॉल में, एकल सेल पाचन के साथ और बिना ईएसी पीडीओ के उप-खेती और क्रायोप्रिजर्वेशन के फायदे और नुकसान का वर्णन किया गया है ताकि शोधकर्ताओं को अपने ऑर्गेनोइड्स को संसाधित करने और जांच करने के लिए एक उपयुक्त विधि चुनने में सक्षम बनाया जा सके।
एसोफेजेल कैंसर (ईसी) दुनिया भर में कैंसर से मृत्यु का दसवां सबसे आम और छठा प्रमुख कारण है। एसोफेजेल एडेनोकार्सिनोमा (ईएसी) ईसी के प्रमुख हिस्टोलॉजिक उपप्रकारों में से एक है और मुख्य रूप सेपश्चिमी देशों में होता है। हाल के दशक में, जर्मनी सहित कई विकसित देशों में ईएसी की घटनाओं में काफी वृद्धि हुईहै। कैंसर की आक्रामकता और ट्यूमर के विकास के शुरुआती चरण के दौरान लक्षणों की कमी के कारण, ईएसी रोगियों में समग्र पूर्वानुमान खराब है, जो लगभग 20% 2,4,5 की 5 साल की जीवित रहने की दर दिखाता है।
बीसवीं शताब्दी के उत्तरार्ध से, ईएसी के जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए कई मॉडल स्थापित किए गए हैं। क्लासिक मानव ईएसी सेल लाइनें जो 1990 के दशक में स्थापित की गई थीं,ईएसी ट्यूमर जीव विज्ञान, ट्यूमर आनुवांशिकी के साथ-साथ एंटी-ट्यूमर रणनीतियों के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार करती हैं, और आमतौर पर ईएसी अनुसंधान में उपयोग की जाती हैं। इसके अलावा, कुछ शोध समूहों ने ईएसी या बैरेट के एसोफैगस के पशु मॉडल को सफलतापूर्वक विकसित किया है, जो जानवरों को ज्ञात जोखिम कारकों जैसे सर्जिकल या भड़काऊ दृष्टिकोण 7,8,9 के माध्यम से गैस्ट्रोओसोफेगल रिफ्लक्स जैसे ज्ञात जोखिम कारकों से अवगत कराते हैं। इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) मॉडल जो ईएसी प्राथमिक कैंसर के ऊतकों को चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक रूप से इम्यूनोडेफिसिएंट चूहों में संलग्न करते हैं, को मानव ईएसी ट्यूमर जैविक व्यवहार और ट्यूमर पर्यावरण10,11,12 का अनुकरण करने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, इन मॉडलों के बावजूद नैदानिक अनुप्रयोगों में सुधार और ईएसी और प्रगति के पीछे आणविक तंत्र की हमारी समझ के बावजूद, इन शोध मॉडलों से मनुष्यों के लिए परिणामों को एक्सट्रपलेशन करने के लिए अभी भी एक बड़ी चुनौती है।
रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) एक 3 डी संस्कृति प्रणाली में उगाए जाते हैं जो विट्रो में मानव विकास और अंग पुनर्जनन की नकल करता है। रोगियों के प्राथमिक ऊतक से उत्पन्न, पीडीओ मानव ट्यूमर की आणविक और फेनोटाइपिक विशेषताओं को दोहराते हैं और दवा के विकास और व्यक्तिगत कैंसर उपचार13,14 में आशाजनक अनुप्रयोगों को दिखाते हैं। अपने युग्मित ट्यूमर ऊतक के साथ ईएसी पीडीओ के दस मामलों की तुलना करके, ईएसी पीडीओ को प्राथमिक ट्यूमर के साथ समान हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं और जीनोमिक परिदृश्य को साझा करने, इंट्रा-ट्यूमर विषमता को बनाए रखने और विट्रो15 में कुशल दवा स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करने की सूचना दी जाती है। ईएसी पीडीओ का उपयोग रोगी-व्युत्पन्न कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएएफ) के साथ ईएसी ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने में भी किया गया था, जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट अनुसंधान16 के क्षेत्र में एक शक्तिशाली अनुप्रयोग का संकेत देता है। दुर्भाग्य से, ईएसी पीडो के विकास और प्रचार के लिए सीमित प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। यहां, EAC PDOs को विस्तार से उप-संस्कृति और संरक्षित करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है: एकल सेल पाचन के साथ और बिना। ईएसी पीडीओ और उनके अनुप्रयोगों के रखरखाव के लिए मानकीकृत तरीके शोधकर्ताओं को अपने ईएसी पीडीओ अनुसंधान में विभिन्न उद्देश्यों के लिए उपयुक्त तरीकों का चयन करने के लिए समर्थन कर सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, ईएसी पीडीओ के दो अलग-अलग उपसंस्कृति और क्रायोप्रिजर्वेशन विधियों का वर्णन किया गया है, यानी, एकल सेल पाचन के साथ और बिना। कई अध्ययनों ने एकल सेल पाचन15,17 के साथ ईएस?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को कोलन फॉर्च्यून प्रोग्राम / चिकित्सा के संकाय, कोलोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। हम सुसान Neiss, Michaela Heitmann, और Anke Wienand-Dorweiler से तकनीकी सहायता का धन्यवाद करते हैं। Ningbo फैन को गुआंगज़ौ एलीट छात्रवृत्ति परिषद (GESC) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। लेखकों ने भाषाई संपादन में उनकी सहायता के लिए डॉ जोशुआ डी’रोजारियो को धन्यवाद दिया।
Equipment | |||
-20°C Freezer | Bosch | Economic | |
-80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
Material | |||
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
Reagent/Chemical | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
Gastrin | Sigma | G9020 | |
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
Y-27632 | Sigma | Y0503 |