תת-תרבות ושימור בהקפאה של אורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט: יתרונות וחסרונות לעיכול תאים בודדים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השיטות של תת-תרבות ושימור בהקפאה של אורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט עם ובלי עיכול של תאים בודדים כדי לאפשר לחוקרים לבחור אסטרטגיות מתאימות על סמך התכנון הניסויי שלהם.
Abstract
היעדרם של מודלים מחקריים תרגומיים מתאימים המשקפים מחלה ראשונית כדי לחקור גידולים ואסטרטגיות טיפוליות הוא מכשול מרכזי באדנוקרצינומה של הוושט (EAC). אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) התגלו לאחרונה כמודל פרה-קליני יוצא דופן במגוון סוגי סרטן. עם זאת, ישנם עדיין פרוטוקולים מוגבלים הזמינים לפיתוח מחשבי כף יד מסוג EAC. לאחר התבססות ה-PDOs, ההתפשטות וההקפאה החיוניות לניתוחים נוספים במורד הזרם. כאן, שתי שיטות שונות תוקנו עבור תת-תרבות של EAC PDOs ושימור בהקפאה, כלומר עם ובלי עיכול של תאים בודדים. שתי השיטות יכולות להשיג באופן אמין את כדאיות התא המתאימה והן ישימות עבור מערך ניסויי מגוון. המחקר הנוכחי הראה כי תת-תרבות של PDOs EAC עם עיכול של תאים בודדים מתאימה לרוב הניסויים הדורשים בקרת מספר תאים, צפיפות אחידה ומבנה חלול המאפשר מעקב אחר גודל. עם זאת, השיטה המבוססת על תאים בודדים מראה צמיחה איטית יותר בתרבית, כמו גם לאחר גידול מחדש ממלאי קפוא. חוץ מזה, תת-תרבות עם עיכול של תאים בודדים מאופיינת ביצירת מבנים חלולים עם ליבה חלולה. לעומת זאת, עיבוד PDOs EAC ללא עיכול של תאים בודדים הוא חיובי עבור שימור בהקפאה, הרחבה ואפיון היסטולוגי. בפרוטוקול זה מתוארים היתרונות והחסרונות של תת-תרבות ושימור בהקפאה של PDOs EAC עם ובלי עיכול של תאים בודדים כדי לאפשר לחוקרים לבחור שיטה מתאימה לעיבוד וחקירה של האורגנואידים שלהם.
Introduction
סרטן הוושט (EC) הוא הגורם העשירי בשכיחותו והשישי המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם1. אדנוקרצינומה של הוושט (EAC) היא אחד מתתי-הסוגים ההיסטולוגיים העיקריים של EC ומתרחשת בעיקר במדינות המערב2. בעשור האחרון, שכיחות ה- EAC עלתה באופן משמעותי במדינות מפותחות רבות, כולל גרמניה3. בשל האגרסיביות של הסרטן וחוסר הסימפטומים בשלב המוקדם של התפתחות הגידול, הפרוגנוזה הכוללת בחולי EAC גרועה, ומראה שיעור הישרדות של 5 שנים של כ -20%2,4,5.
מאז סוף המאה העשרים הוקמו מספר מודלים למחקר הביו-רפואי של EAC. קווי תאי ה-EAC האנושיים הקלאסיים שהוקמו בשנות ה-90 שלהמאה ה-20, מרחיבים את הידע שלנו על ביולוגיה של גידולי EAC, גנטיקה של גידולים כמו גם אסטרטגיות נגד גידולים, ומשמשים בדרך כלל במחקר EAC. חוץ מזה, כמה קבוצות מחקר פיתחו בהצלחה מודלים של בעלי חיים של EAC או הוושט של בארט על ידי חשיפת בעלי החיים לגורמי סיכון ידועים כגון ריפלוקס גסטרו-וושט באמצעות גישות כירורגיות או דלקתיות 7,8,9. בנוסף, מודלים של xenograft (PDX) שמקורם בחולה, אשר משרים רקמות סרטן ראשוניות של EAC באופן תת עורי או אורתוטופי בעכברים אימונודיים, פותחו כדי לדמות התנהגות ביולוגית של גידול EAC אנושי וסביבת הגידול 10,11,12. עם זאת, למרות שהמודלים הללו משפרים את היישומים הקליניים ואת ההבנה שלנו את המנגנונים המולקולריים שמאחורי גידולי EAC והתקדמותם, עדיין קיים אתגר גדול להמחשת תוצאות ממודלים מחקריים אלה לבני אדם.
אורגנואידים של גידול שמקורם בחולה (PDOs) גדלים במערכת תרביות תלת-ממדית המחקה התפתחות אנושית והתחדשות איברים במבחנה. ה-PDOs, שנוצרו מהרקמה הראשונית של המטופלים, משחזרים את המאפיינים המולקולריים והפנוטיפיים של הגידול האנושי והראו יישומים מבטיחים בפיתוח תרופות ובטיפול מותאם אישית בסרטן13,14. על ידי השוואת עשרה מקרים של PDOs EAC עם רקמת הגידול הזוגית שלהם, מדווחים כי EAC PDOs חולקים תכונות היסטופתולוגיות דומות ונוף גנומי עם הגידול הראשוני, שומרים על הטרוגניות תוך גידולית ומאפשרים סינון תרופות יעיל במבחנה15. EAC PDOs שימשו גם בחקר האינטראקציה של תאי גידול EAC עם פיברובלסטים הקשורים לסרטן שמקורם בחולה (CAFs), מה שמצביע על יישום רב עוצמה בתחום המחקר של מיקרו-סביבה של הגידול16. למרבה הצער, היו פרוטוקולים מוגבלים זמינים לפיתוח והפצה של מחשבי כף יד של EAC. כאן מתוארות שתי שיטות שונות לתת-תרבות ולשימור של מחשבי כף יד מסוג EAC בפירוט: עם ובלי עיכול של תאים בודדים. השיטות הסטנדרטיות לתחזוקה של מחשבי כף יד מסוג EAC ויישומיהם יכולות לתמוך בחוקרים לבחור שיטות מתאימות למטרות שונות במחקר ה-EAC PDO שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה מתוארות שתי תת-תרבויות שונות ושיטות שימור בהקפאה של PDOs EAC, כלומר, עם ובלי עיכול של תאים בודדים. מספר מחקרים המליצו על העברת PADO EAC עם עיכול של תאים בודדים15,17, מה שמועיל לרוב הניסויים הדורשים שליטה במספר התאים, צפיפות אחידה ומבנה חלול המאפשר מעקב אח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית קלן פורצ’ן / הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת קלן. אנו מודים על הסיוע הטכני של סוזן נייס, מיכאלה הייטמן ואנקה ויננד-דורוויילר. נינגבו פאן נתמך כספית על ידי מועצת מלגות העילית של גואנגג’ואו (GESC). המחברים מודים לד”ר יהושע ד’רוזאריו על עזרתו בעריכה לשונית.
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. The epidemiology of esophageal adenocarcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B. Cytokeratin 7 (CK7, K7). Pathology Outlines.com website. , (2021).
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
