Här presenterar vi ett reproducerbart in vitro elektroporation protokoll för genetisk manipulation av primära cerebellar granulat cell prekursorer (GCPs) som är kostnadseffektiva, effektiva och livskraftiga. Dessutom visar detta protokoll också en enkel metod för molekylär studie av primära cilium-beroende Hedgehog signalering vägar i primära GCP celler.
Det primära ciliumet är en kritisk signalerande organell som finns på nästan varje cell som omvandlar igelkott (Hh) signalerar stimuli från cellytan. I granulatcellprekursoren (GCP) fungerar det primära ciliumet som ett pivotalt signalcenter som orkestrerar prekursorcellproliferation genom att modulera Hh-signalvägen. Undersökningen av primära cilium-beroende Hh signalering maskiner underlättas av in vitro genetisk manipulation av utbildningsavsnittet komponenter att visualisera deras dynamiska lokalisering till det primära cilium. Transfection av transgenes i de primära kulturerna av GCPs med hjälp av de för närvarande kända elektroporationsmetoderna är dock i allmänhet kostsamt och resulterar ofta i låg cell livskraft och oönskad transfektion effektivitet. Detta dokument introducerar ett effektivt, kostnadseffektivt och enkelt elektroporationsprotokoll som visar en hög transfekteringseffektivitet på ~ 80-90% och optimal cellviabilitet. Detta är en enkel, reproducerbar och effektiv genetisk modifieringsmetod som är tillämplig på studien av den primära ciliumberoende Hedgehog-signalvägen i primära GCP-kulturer.
Cerebellar GCPs används ofta för att studera maskiner i Hh-signalvägen i neuronala stamceller på grund av deras höga överflöd och höga känslighet för Hh-signalvägen in vivo1,2,3,4. I GCPs fungerar det primära ciliumet som ett pivotalT Hh-signaltransduktionsnav5 som orkestrerar spridningen av prekursorcellerna6,7,8. In vitro visualisering av Hh signalering komponenter på det primära cilium är ofta utmanande på grund av deras låga endogena basala nivåer. Därför är transgene modifiering av protein uttryck nivåer och fluorophore taggning av genen av intresse användbara metoder för att studera vägen vid molekylär upplösning. Genetisk manipulation av GCP primära kulturer med liposom-baserade transfection metoder resulterar dock ofta i låg transfection effektivitet, hindrar ytterligare molekylära undersökningar9. Elektroporation ökar effektiviteten men kräver ofta orimliga leverantörsspecifika och celltypsbegränsade elektroporationsreagenser10.
Detta dokument introducerar en högeffektiv och kostnadseffektiv elektroporationsmetod för att manipulera Hh-signalvägskomponenterna i GCP-primärkulturer. Med hjälp av detta modifierade elektroporationsprotokoll levererades ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt Smoothened transgene (pEGFP-Smo) effektivt till GCPs och uppnådde hög cellöverlevnad och transfektion (80-90%). Dessutom, vilket framgår av den immunocytochemical färgning, visade de transfected GCPs hög känslighet för utjämnade agonist-inducerad aktivering av Hh signalvägen genom handel EGFP-Smo till de primära cilierna. Detta protokoll ska vara direkt tillämpligt och fördelaktigt för experiment som inbegriper genetisk modifiering in vitro av celltyper som är svåra att transfektera, såsom primära cellkulturer för människor och gnagare, samt humaninducerade pluripotenta stamceller.
Transfection av transgenes i primär GCP-kultur genom elektroporationsmetod är vanligtvis associerad med låg cellviabilitet och dålig transfektion effektivitet9,10. Detta dokument introducerar ett kostnadseffektivt och reproducerbart elektroporationsprotokoll som har visat hög effektivitet och livskraft. Dessutom visar vi också en enkel metod för att studera den primära cilium-beroende Hh signalvägen i primära GCP celler.
Andr…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av HKBU Seed Fund och Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) till C.H.H. Hor.
GCP Culture | |||
B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
IF staining | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Primary antibody mix | |||
Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Secondary antibody mix | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Electroporation | |||
CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |