Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen
Summary
Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP’s) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.
Abstract
Het primaire cilium is een kritisch signaalorganel dat op bijna elke cel wordt aangetroffen en dat Egel (Hh) signaalprikkels van het celoppervlak transduceert. In de granulaatcelvoorloper (GCP) fungeert het primaire cilium als een cruciaal signaleringscentrum dat de proliferatie van voorlopercellen orkestreert door de Hh-signaalroute te moduleren. Het onderzoek van primaire cilium-afhankelijke Hh-signaleringsmachines wordt vergemakkelijkt door in vitro genetische manipulatie van de pathway-componenten om hun dynamische lokalisatie naar het primaire cilium te visualiseren. Transfectie van transgenen in de primaire culturen van GCP’s met behulp van de momenteel bekende elektroporatiemethoden is echter over het algemeen kostbaar en resulteert vaak in een lage levensvatbaarheid van cellen en ongewenste transfectie-efficiëntie. Dit artikel introduceert een efficiënt, kosteneffectief en eenvoudig elektroporatieprotocol dat een hoge transfectie-efficiëntie van ~ 80-90% en optimale levensvatbaarheid van de cel aantoont. Dit is een eenvoudige, reproduceerbare en efficiënte genetische modificatiemethode die van toepassing is op de studie van de primaire ciliumafhankelijke egelsignaleringsroute in primaire GCP-culturen.
Introduction
Cerebellaire GCP’s worden veel gebruikt om de machinerie van de Hh-signaleringsroute in neuronale voorloperceltypen te bestuderen vanwege hun hoge abundantie en hoge gevoeligheid voor de Hh-signaleringsroute in vivo1,2,3,4. In GCP’s fungeert het primaire cilium als een cruciale Hh-signaaltransductiehub5 die de proliferatie van de voorlopercellen orkestreert6,7,8. In vitro visualisatie van Hh-signaleringscomponenten op het primaire cilium is vaak een uitdaging vanwege hun lage endogene basale niveaus. Vandaar dat transgene modificatie van eiwitexpressieniveaus en fluorofoor tagging van het gen van belang nuttige benaderingen zijn om de route met moleculaire resolutie te bestuderen. Genetische manipulatie van primaire GCP-culturen met behulp van op liposomen gebaseerde transfectiebenaderingen resulteert echter vaak in een lage transfectie-efficiëntie, waardoor verder moleculair onderzoek wordt belemmerd9. Elektroporatie verhoogt de efficiëntie, maar vereist vaak exorbitante leverancierspecifieke en celtype-beperkte elektroporatiereagentia10.
Dit artikel introduceert een zeer efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om de Hh-signaalroutecomponenten in GCP-primaire culturen te manipuleren. Met behulp van dit gemodificeerde elektroporatieprotocol werd een groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld smoothened transgen (pEGFP-Smo) efficiënt afgeleverd aan GCP’s en bereikte het hoge celoverlevings- en transfectiesnelheden (80-90%). Bovendien, zoals blijkt uit de immunocytochemische kleuring, vertoonden de getransfecteerde GCP’s een hoge gevoeligheid voor gladgestreken agonist-geïnduceerde activering van de Hh-signaleringsroute door EGFP-Smo naar de primaire trilharen te smokkelen. Dit protocol is rechtstreeks toepasselijk en gunstig voor experimenten waarbij in vitro genetische modificatie van moeilijk te transfecteren celtypen, zoals primaire celculturen bij mens en knaagdier, alsmede door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, betrokken zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfectie van transgenen in primaire GCP-cultuur door elektroporatiemethode wordt meestal geassocieerd met een lage levensvatbaarheid van cellen en een slechte transfectie-efficiëntie9,10. Dit artikel introduceert een kosteneffectief en reproduceerbaar elektroporatieprotocol dat een hoge efficiëntie en levensvatbaarheid heeft aangetoond. Daarnaast demonstreren we ook een eenvoudige methode voor het bestuderen van de primaire ciliumafhankelijke Hh-signalerings…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door HKBU Seed Fund en Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) aan C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
