שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.
Abstract
הסיליום העיקרי הוא אברון איתות קריטי שנמצא כמעט בכל תא שמתמר את הקיפוד (Hh) ומאותת לגירויים מפני השטח של התא. במבשר תאי הגרגיר (GCP), הסיליום הראשי משמש כמרכז איתות מרכזי המתזמר את התפשטות התאים המבשרים על ידי ויסות מסלול האיתות של Hh. החקירה של מכונות איתות Hh תלויות cilium העיקרית מתאפשרת על ידי מניפולציה גנטית במבחנה של רכיבי המסלול כדי לדמיין את הלוקליזציה הדינמית שלהם לסיליום הראשי. עם זאת, טרנספקטציה של טרנסג’נים בתרבויות העיקריות של GCPs באמצעות שיטות אלקטרופורציה הידועות כיום היא בדרך כלל יקרה ולעתים קרובות גורמת בכדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטורה לא רצויה. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה יעיל, חסכוני ופשוט המדגים יעילות טרנספקטירה גבוהה של ~ 80-90% ואת הכדאיות התא האופטימלית. זוהי שיטת שינוי גנטי פשוטה, ניתנת לשחזור ויעילה החלה על חקר מסלול האיתות העיקרי התלוי בסיליום בתרבויות GCP ראשוניות.
Introduction
GCPs המוח הקטן נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד את המכונות של מסלול איתות Hh בסוגי תאים אב עצביים בשל השפע הגבוה שלהם רגישות גבוהה למסלול איתות Hh ב vivo1,2,3,4. ב- GCPs, הסיליום העיקרי פועל כרכזת העברת אות Hh מרכזית 5 המתזמרת את התפשטות התאים המבשרים6,7,8. הדמיה חוץ גופית של רכיבי איתות Hh על הסיליום הראשי הוא לעתים קרובות מאתגר בשל רמות הבסיס האנדוגניות הנמוכות שלהם. לפיכך, שינוי טרנסג’ן של רמות ביטוי חלבון ותיוג פלואורופור של גן העניין הן גישות שימושיות כדי ללמוד את המסלול ברזולוציה מולקולרית. עם זאת, מניפולציה גנטית של תרבויות ראשיות GCP באמצעות גישות transfection מבוססות ליפוזום לעתים קרובות לגרום יעילות טרנספקטיבה נמוכה, מעכב חקירות מולקולריות נוספות9. אלקטרופורציה מגבירה את היעילות אך בדרך כלל דורשת ריאגנטים אלקטרופורציה ספציפיים לספקים מופקעים וסוג התאים 10.
מאמר זה מציג שיטת אלקטרופורציה יעילה וחסכונית לתפעול רכיבי מסלול האיתות של Hh בתרבויות הראשיות של GCP. באמצעות פרוטוקול אלקטרופורציה שונה זה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מתויג טרנסג’ן החלקה (pEGFP-Smo) נמסר ביעילות GCPs והשיג שיעורי הישרדות וטרנספקטיה גבוהים של תאים (80-90%). יתר על כן, כפי שמעיד הכתם החיסוני, GCPs שהושפעו הטרנסג’נדרים הראו רגישות גבוהה להפעלה אגוניסטית החלקה של מסלול האיתות HH על ידי סחר EGFP-Smo לסיסים העיקריים. פרוטוקול זה יהיה ישים ישירות ומועיל לניסויים הכרוכים בשינוי גנטי במבחנה של סוגי תאים שקשה להעביר, כגון תרביות תאים ראשוניים אנושיים ומכרסמים, כמו גם תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
טרנספקטציה של טרנסג’נים בתרבות GCP ראשונית על ידי שיטת אלקטרופורציה קשורה בדרך כלל עם כדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטיבה ירודה9,10. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה חסכוני וניתן לשחזור שהפגין יעילות גבוהה וכדאיות. בנוסף, אנו גם מדגימים שיטה פשוטה של לימו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן הזרעים HKBU ומענק הסטארט-אפ Tier-2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009), קרן מחקר מועצת המחקר השיתופית של המועצה למענק מחקר (CRF-C2103-20GF) ל- C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
