Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di elettroporazione riproducibile in vitro per la manipolazione genetica dei precursori delle cellule del granulo cerebellare primario (GCP) che è economico, efficiente e praticabile. Inoltre, questo protocollo dimostra anche un metodo semplice per lo studio molecolare delle vie di segnalazione primarie del riccio cilio-dipendenti nelle cellule GCP primarie.
Abstract
Il cilio primario è un organello di segnalazione critico che si trova su quasi tutte le cellule che trasducono gli stimoli di segnalazione hedgehog (Hh) dalla superficie cellulare. Nel precursore delle cellule del granulo (GCP), il cilio primario agisce come un centro di segnalazione cardine che orchestra la proliferazione delle cellule precursori modulando la via di segnalazione Hh. Lo studio del meccanismo di segnalazione Hh cilium-dipendente primario è facilitato dalla manipolazione genetica in vitro dei componenti del percorso per visualizzare la loro localizzazione dinamica al cilio primario. Tuttavia, la trasfezione di transgeni nelle colture primarie di GCP utilizzando i metodi di elettroporazione attualmente noti è generalmente costosa e spesso si traduce in bassa vitalità cellulare ed efficienza di trasfezione indesiderata. Questo documento introduce un protocollo di elettroporazione efficiente, economico e semplice che dimostra un’elevata efficienza di trasfezione di ~ 80-90% e una fattibilità ottimale delle celle. Questo è un metodo di modificazione genetica semplice, riproducibile ed efficiente che è applicabile allo studio della via di segnalazione primaria del riccio cilio-dipendente in colture primarie GCP.
Introduction
I GCP cerebellari sono ampiamente utilizzati per studiare il meccanismo della via di segnalazione Hh nei tipi di cellule progenitrici neuronali a causa della loro elevata abbondanza e alta sensibilità alla via di segnalazione Hh in vivo1,2,3,4. Nei GCP, il cilio primario agisce come un hub cardine di trasduzione del segnale Hh5 che orchestra la proliferazione delle cellule precursori6,7,8. La visualizzazione in vitro dei componenti di segnalazione Hh sul cilio primario è spesso difficile a causa dei loro bassi livelli basali endogeni. Quindi, la modifica transgenica dei livelli di espressione proteica e il tagging fluoroforico del gene di interesse sono approcci utili per studiare il percorso a risoluzione molecolare. Tuttavia, la manipolazione genetica delle colture primarie GCP utilizzando approcci di trasfezione basati su liposomi spesso si traduce in una bassa efficienza di trasfezione, ostacolando ulteriori indagini molecolari9. L’elettroporazione aumenta l’efficienza, ma in genere richiede reagenti di elettroporazione esorbitanti specifici del fornitore e limitati al tipo di cella10.
Questo documento introduce un metodo di elettroporazione ad alta efficienza ed economico per manipolare i componenti del percorso di segnalazione Hh nelle colture primarie GCP. Utilizzando questo protocollo di elettroporazione modificato, un transgene Smoothened marcato con proteina fluorescente verde (GFP) (pEGFP-Smo) è stato consegnato in modo efficiente ai GCP e ha raggiunto alti tassi di sopravvivenza e trasfezione cellulare (80-90%). Inoltre, come evidenziato dalla colorazione immunocitochimica, i GCP trasfettati hanno mostrato un’elevata sensibilità all’attivazione indotta da agonisti smoothened della via di segnalazione Hh trafficando EGFP-Smo alle ciglia primarie. Il presente protocollo è direttamente applicabile e vantaggioso per gli esperimenti che comportano la modificazione genetica in vitro di tipi cellulari difficili da trasfettare, come le colture cellulari primarie umane e di roditori, nonché le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La trasfezione di transgeni in coltura GCP primaria con metodo di elettroporazione è tipicamente associata a una bassa vitalità cellulare e a una scarsa efficienza di trasfezione9,10. Questo documento introduce un protocollo di elettroporazione economico e riproducibile che ha dimostrato alta efficienza e fattibilità. Inoltre, dimostriamo anche un metodo semplice per studiare la via di segnalazione Hh primaria cilium-dipendente nelle cellule GCP primarie.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da HKBU Seed Fund e Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) a C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
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