Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.
O cílio primário é uma organela de sinalização crítica encontrada em quase todas as células que transduzem os estímulos de sinalização de Hedgehog (HH) da superfície celular. No precursor da célula de grânulo (GCP), o cílio primário atua como um centro de sinalização crucial que orquestra a proliferação de células precursoras modulando a via de sinalização HH. A investigação do maquinário de sinalização HH, dependente do cítio primário, é facilitada pela manipulação genética in vitro dos componentes da via para visualizar sua localização dinâmica para o círio primário. No entanto, a transfecção de transgenes nas culturas primárias dos GCPs usando os métodos de eletroporação atualmente conhecidos é geralmente cara e muitas vezes resulta em baixa viabilidade celular e eficiência de transfecção indesejável. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação eficiente, econômico e simples que demonstra uma alta eficiência de transfecção de ~80-90% e a viabilidade celular ideal. Trata-se de um método de modificação genética simples, reprodutível e eficiente que é aplicável ao estudo da via de sinalização de Ouriço dependente do cilium primário nas culturas primárias do GCP.
Os GCPs cerebelares são amplamente utilizados para estudar o maquinário da via de sinalização HH em tipos de células progenitoras neuronais devido à sua alta abundância e alta sensibilidade à via de sinalização HH em vivo1,2,3,4. Em GCPs, o cílio primário atua como um hub de transdução de sinal HH crucial5 que orquestra a proliferação das células precursoras6,7,8. A visualização in vitro de componentes de sinalização de HH no cílio primário é muitas vezes desafiadora devido aos seus baixos níveis basais endógenos. Assim, a modificação transgênica dos níveis de expressão proteica e a marcação fluorófora do gene de interesse são abordagens úteis para estudar o caminho na resolução molecular. No entanto, a manipulação genética das culturas primárias do GCP usando abordagens de transfecção baseadas em liposome muitas vezes resultam em baixa eficiência de transfecção, dificultando novas investigações moleculares9. A eletroporação aumenta a eficiência, mas geralmente requer reagentes de eletroporação exorbitantes específicos do fornecedor e restritos ao tipo celular10.
Este artigo introduz um método de eletroporação de alta eficiência e custo-benefício para manipular os componentes da via de sinalização HH nas culturas primárias GCP. Usando este protocolo de eletroporação modificado, um transgene smoothened smoothened (pEGFP-Smo) com marca verde foi fornecido eficientemente aos GCPs e alcançou altas taxas de sobrevivência celular e transfecção (80-90%). Além disso, como evidenciado pela coloração imunocitômica, os GCPs transfectados mostraram alta sensibilidade à ativação agonista induzida pelo HH pelo tráfico de EGFP-Smo para a cília primária. Este protocolo deve ser diretamente aplicável e benéfico para experimentos que envolvem modificação genética in vitro de tipos celulares difíceis de transfetar, como culturas de células primárias humanas e roedores, bem como células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.
A transfecção de transgenes na cultura GCP primária pelo método de eletroporação é tipicamente associada à baixa viabilidade celular e à baixa eficiência de transfecção9,10. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação econômico e reprodutível que demonstrou alta eficiência e viabilidade. Além disso, também demonstramos um método simples de estudar a via de sinalização HH dependente do círio primário nas células GCP primárias.
…The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelo HKBU Seed Fund e Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) para C.H.H. Hor.
GCP Culture | |||
B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
IF staining | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Primary antibody mix | |||
Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Secondary antibody mix | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
Electroporation | |||
CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |