Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi
Summary
Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP’ ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.
Abstract
Birincil sicim, hücre yüzeyinden sarkıt sinyali veren Kirpi (Hh) ileten hemen hemen her hücrede bulunan kritik bir sinyal organıdır. Granül hücre öncüsünde (GCP), birincil sicim, Hh sinyal yolunu modüle ederek öncü hücre çoğalmasını düzenleyen önemli bir sinyal merkezi görevi görür. Birincil sicime bağımlı Hh sinyal makinelerinin araştırılması, birincil sicime dinamik lokalizasyonlarını görselleştirmek için yol bileşenlerinin in vitro genetik manipülasyonu ile kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, GCP’lerin birincil kültürlerinde transgenlerin şu anda bilinen elektroporasyon yöntemlerini kullanarak transeksiyonu genellikle maliyetlidir ve genellikle düşük hücre canlılığı ve istenmeyen transeksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Bu makale, ~%80-90 arasında yüksek transfeksiyon verimliliği ve optimum hücre canlılığı gösteren verimli, uygun maliyetli ve basit bir elektroporasyon protokolü sürmektedir. Bu, birincil GCP kültürlerinde birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yolunun incelenmesi için geçerli olan basit, tekrarlanabilir ve verimli bir genetik modifikasyon yöntemidir.
Introduction
Serebellar GCP’ler, yüksek bollukları ve vivo1,2,3,4’teki Hh sinyal yoluna karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle nöronal progenitör hücre tiplerinde Hh sinyal yolunun makinelerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. GCP’lerde, birincil eksiyum öncü hücrelerin çoğalmasını düzenleyen önemli bir Hh sinyal transdüksiyon merkezi5 görevi görür6,7,8. Birincil sicim üzerindeki Hh sinyal bileşenlerinin in vitro görselleştirmesi, düşük endojen bazal seviyeleri nedeniyle genellikle zordur. Bu nedenle, protein ekspresyon seviyelerinin transgene modifikasyonu ve ilgi geninin florofor etiketlemesi moleküler çözünürlükte yolu incelemek için yararlı yaklaşımlardır. Bununla birlikte, lipozom bazlı transfeksiyon yaklaşımları kullanılarak GCP birincil kültürlerinin genetik manipülasyonu genellikle düşük transeksiyon verimliliği ile sonuçlanır ve daha fazla moleküler araştırmayı engeller9. Elektroporasyon verimliliği artırır, ancak genellikle fahiş satıcıya özgü ve hücre tipi kısıtlı elektroporasyon reaktifleri gerektirir10.
Bu makale, GCP birincil kültürlerindeki Hh sinyal yolu bileşenlerini manipüle etmek için yüksek verimli ve uygun maliyetli bir elektroporasyon yöntemi sönmektedir. Bu modifiye elektroporasyon protokolü kullanılarak, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Yumuşatılmış transgene (pEGFP-Smo) GCP’lere verimli bir şekilde teslim edildi ve yüksek hücre sağkalım ve transfeksiyon oranlarına (%80-90) ulaşıldı. Ayrıca, immünosimyasal lekelemenin kanıt ettiği gibi, transfected GCP’ler, EGFP-Smo’yu birincil cilia’ya aktararak Hh sinyal yolunun yumuşatılmış agonist kaynaklı aktivasyonuna karşı yüksek hassasiyet göstermiştir. Bu protokol, insan ve kemirgen birincil hücre kültürleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler gibi transfect edilmesi zor hücre türlerinin in vitro genetik modifikasyonu içeren deneyler için doğrudan uygulanabilir ve faydalı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birincil GCP kültüründeki transjenlerin elektroporasyon yöntemi ile transeksiyonu tipik olarak düşük hücre canlılığı ve zayıf transeksiyon verimliliği9,10 ile ilişkilidir. Bu makale, yüksek verimlilik ve canlılık gösteren uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir elektroporasyon protokolü salamıştır. Ek olarak, birincil GCP hücrelerinde birincil sicime bağımlı Hh sinyal yolunu incelemek için basit bir yöntem de gösteriyoruz.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma HKBU Tohum Fonu ve Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) tarafından C.H.H. Hor’a desteklendi.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
