Generación de modelo de isquemia-reperfusión de gancho utilizando un embrión de pollito en desarrollo de tres días
Summary
Este artículo describe el modelado de isquemia-reperfusión (I / R) en un embrión de pollito de 3 días utilizando un gancho personalizado de aguja espinal para comprender mejor el desarrollo y el tratamiento de I / R. Este modelo es simple, rápido y económico.
Abstract
La isquemia y los trastornos de reperfusión (I / R), como el infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular y la enfermedad vascular periférica, son algunas de las principales causas de enfermedad y muerte. Muchos modelos in vitro e in vivo están actualmente disponibles para estudiar el mecanismo I/R en enfermedades o tejidos dañados. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha informado de ningún modelo in ovo I/R, lo que permitiría una mejor comprensión de los mecanismos I/R y un cribado farmacológico más rápido. Este artículo describe el modelado de I / R utilizando un gancho personalizado de aguja espinal en un embrión de pollito de 3 días para comprender el desarrollo de I / R y los mecanismos de tratamiento. Nuestro modelo se puede utilizar para investigar anomalías a nivel de ADN, ARN y proteínas. Este método es simple, rápido y económico. El modelo actual se puede utilizar de forma independiente o en conjunto con los modelos I/R in vitro e in vivo existentes.
Introduction
La lesión tisular por isquemia-reperfusión se ha relacionado con una serie de patologías, incluidos ataques cardíacos, accidente cerebrovascular isquémico, traumatismos y enfermedad vascular periférica1,2,3,4,5. Esto se debe principalmente a la falta de una comprensión integral de la progresión de la enfermedad y la falta de un modelo de investigación efectivo. La lesión isquémica ocurre cuando se corta el suministro de sangre a un área específica del tejido. Como resultado, el tejido isquémico eventualmente se necrotiza, aunque la tasa varía según el tejido. Por lo tanto, restaurar el suministro de sangre puede ayudar a mitigar el daño. Sin embargo, se ha observado, en algunos casos, que la reperfusión causa más daño tisular que la isquemia sola6,7,8. Por lo tanto, se requiere comprender los mecanismos moleculares y celulares de la isquemia-reperfusión para desarrollar una intervención terapéutica efectiva. Actualmente, no se conoce un tratamiento efectivo para las lesiones I/R. Esta disparidad ha impulsado la creación de nuevos modelos experimentales, que van desde modelos in vitro hasta modelos in vivo, para abordar el problema existente9,10,11,12,13.
Los embriones de pollito (Gallus gallus domesticus) son ampliamente utilizados en la investigación debido a su facilidad de acceso, aceptabilidad ética, tamaño relativamente grande (en comparación con otros embriones), bajo costo y rápido crecimiento14. Utilizamos un embrión de pollito a las 72 h de desarrollo para crear un in ovo I/R ocluyendo y liberando la arteria vitelina derecha con la ayuda de una aguja espinal. Lo llamamos el modelo hook-I/R isquemia-reperfusión (Figura 1). El modelo utilizado en este estudio es capaz de simular con precisión todos los procesos posteriores, incluidas las vías oxidativas e inflamatorias, que se asocian frecuentemente con el daño I/R15,16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de la investigación de isquemia-reperfusión es crear estrategias terapéuticas que prevengan la muerte celular y promuevan la recuperación29,30. Para superar las limitaciones actuales en la investigación de I / R, diseñamos un modelo de embrión de pollito Hook I / R para producir un modelo I / R confiable y reproducible. Hasta donde sabemos, el nuestro es el primer modelo de I / R jamás creado en un embrión de pollito de 3 días para experimen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos expresar nuestro agradecimiento a Hari Shankar por sus aportes críticos durante la videografía y la edición, al Sr. Baqer Hussain por la voz en off, al Sr. Asghar Rizvi por la edición de video, al Sr. Mohammad Haider por las grabaciones de video, al Sr. Mohammad Danish Siddiqui por la asistencia durante los experimentos.
Materials
| (-80°C) freezer | Haier, China | – | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | – | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | – | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | – | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | – | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | – | – | |
| Egg rack | – | – | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | – | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | – | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | – | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | – | – | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
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