Génération d’un modèle Hook Ischemia-Reperfusion à l’aide d’un embryon de poussin en développement de trois jours

Summary

Cet article décrit la modélisation de l’ischémie-reperfusion (I / R) dans un embryon de poussin de 3 jours à l’aide d’un crochet personnalisé à l’aiguille de la colonne vertébrale pour mieux comprendre le développement et le traitement de l’I / R. Ce modèle est simple, rapide et peu coûteux.

Abstract

L’ischémie et les troubles de la reperfusion (I / R), tels que l’infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies vasculaires périphériques, sont quelques-unes des principales causes de maladie et de décès. De nombreux modèles in vitro et in vivo sont actuellement disponibles pour étudier le mécanisme I/R dans la maladie ou les tissus endommagés. Cependant, à ce jour, aucun modèle in ovo I/R n’a été rapporté, ce qui permettrait de mieux comprendre les mécanismes I/R et d’accélérer le dépistage des drogues. Cet article décrit la modélisation I/R à l’aide d’un crochet personnalisé à l’aiguille de la colonne vertébrale dans un embryon de poussin de 3 jours pour comprendre les mécanismes de développement et de traitement de l’I/R. Notre modèle peut être utilisé pour étudier les anomalies au niveau de l’ADN, de l’ARN et des protéines. Cette méthode est simple, rapide et peu coûteuse. Le modèle actuel peut être utilisé indépendamment ou en conjonction avec des modèles I/R in vitro et in vivo existants.

Introduction

Les lésions tissulaires d’ischémie-reperfusion ont été liées à un certain nombre de pathologies, notamment les crises cardiaques, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les traumatismes et les maladies vasculaires périphériques1,2,3,4,5. Cela est principalement dû à l’absence d’une compréhension globale de la progression de la maladie et à l’absence d’un modèle de recherche efficace. Une lésion ischémique se produit lorsque l’apport sanguin à une zone spécifique du tissu est coupé. En conséquence, le tissu ischémique finit par se nécroser, bien que le taux varie en fonction du tissu. Par conséquent, la restauration de l’approvisionnement en sang peut aider à atténuer les dommages. Cependant, il a été observé, dans certains cas, que la reperfusion provoque plus de dommages tissulaires que l’ischémie ^seule6,7,8. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de l’ischémie-reperfusion est nécessaire pour développer une intervention thérapeutique efficace. À l’heure actuelle, aucun traitement efficace pour les lésions I/R n’est connu. Cette disparité a incité à la création de nouveaux modèles expérimentaux, allant des modèles in vitro aux modèles in vivo, pour résoudre le problème existant9,10,11,12,13.

Les embryons de poussins (Gallus gallus domesticus) sont largement utilisés dans la recherche en raison de leur facilité d’accès, de leur acceptabilité éthique, de leur taille relativement grande (par rapport à d’autres embryons), de leur faible coût et de leur croissance ^rapide14. Nous avons utilisé un embryon de poussin à 72 h de développement pour créer un in ovo I/R en obstruant et en libérant l’artère droite de vitelline à l’aide d’une aiguille spinale. Nous l’avons nommé le modèle Hook-I/R ischemia-reperfusion (Figure 1). Le modèle utilisé dans cette étude est capable de simuler avec précision tous les processus en aval, y compris les voies oxydatives et inflammatoires, qui sont fréquemment associées à des dommages I/R15,16,17.

Protocol

Le comité d’éthique animale institutionnelle du Lucknow Medical College and Hospital d’Era a émis une renonciation écrite indiquant qu’aucune approbation formelle n’était requise pour mener ces expériences conformément au Comité aux fins du contrôle et de la supervision des expériences sur les animaux (CPCSEA). Cependant, les procédures opérationnelles normalisées ont été suivies afin de minimiser tout risque de détresse embryonnaire. 1. Préparation du tampon (ta…

Representative Results

La technique d’imagerie du flux sanguin Doppler a été utilisée pour évaluer l’efficacité de notre modèle. En bref, nous avons comparé les données du groupe témoin avec les données du groupe RVA pour déterminer le succès de notre création. La figure 4A illustre un flux typique associé à l’animal témoin, tandis que la figure 4B illustre les résultats obtenus à partir d’un ARV. Le numérique 1-8 représente les différents événements ass…

Discussion

L’objectif de la recherche sur l’ischémie-reperfusion est de créer des stratégies thérapeutiques qui préviennent la mort cellulaire et favorisent la ^{récupération29,30}. Pour surmonter les contraintes actuelles dans la recherche I/R, nous avons conçu un modèle d’embryon de poussin Hook I/R pour produire un modèle I/R fiable et reproductible. À notre connaissance, le nôtre est le premier modèle I/R jamais créé dans un embryon de poussin de 3 jou…

Materials

(-80°C) freezer	Haier, China	–
1.5mL Centrifuge tube	TARSONS, India	500010X
100mm Petri dish (sterile)	Tarsons, India	460050
18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm)	Ramsons, India	13990
1mL Syringe	DISPO VAN	–
26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm)	DISPO VAN, india	30722D
37°C egg incubator with adjustable percentage humidity	Gentek, India	GL-100
37°C laboratory incubator	SCIENCE TECH, India	CB 101-14
3-Methyladenine (3-MA)	Sigma Aldrich, USA	M9281
3mL Pasture Pipette	TARSONS, India	940050
50mL Beaker	TARSONS, India	–
5mL Syringe	DISPO VAN, India	IP53
70% ethanol	Merck Millipore, United States	64-17-5
Adhesive tape/Cello tape	Sunrise, India	–
Ambra1 primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00387943_m1
Anti-mouse IgG	Cell Signaling Technology, USA	7076S
Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories, USA	711-035-152
Atg7	R&D Systems, USA	MAB6608
Atg7 primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs00893766_m1
Autoclave Bag	Tarsons, India	550022
Autoclave Machine	Local made, Lucknow, India	–
Beclin-1	Proteintech, USA	66665-1-Ig
Beta Actin	ImmunoTag, USA	ITT07018
Bovine Serum Albumin	Himedia, Mumbai, India	TC194
Calcium Chloride	Himedia, Mumbai, India	GRM534
Catalase	ImmunoTag, USA	ITT5155
Cleaning wipes	Kimberly-Clark, India	370080
Cleaved Caspase3	ImmunoTag, USA	ITT07022
di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate	Himedia, Mumbai, India	GRM39611
Doppler blood flowmeter	Moors instrument, United Kingdom	moorVMS-LDF1
Egg rack	–	–
Egg rack	–	–
GAPDH	ImmunoTag, USA	M1000110
GAPDH primers	Applied Biosystems, Foster city, USA	Hs02758991_g1
Glycine	Himedia, Mumbai, India	MB013
Kidney tray	HOSPITO	–
LC3A/B	Cell Signaling Technology, USA	4108S
Methanol	Rankem laboratories, Mumbai, India	M0252
Micromanipulator	Narishige, Japan	M-152
N-acetyl-L-cysteine (NAC)	Sigma Aldrich, USA	A7250
Naringenin	Sigma Aldrich, USA	67604-48-2
NF-kβ	Thermo Fisher Scientific, USA	51-0500
NLRP3	ImmunoTag, USA	ITT07438
Nose plier	Local made, Lucknow, India	–
Ocular forceps	Stoelting, Germany	52106-40
Ocular iris	Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India	Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8"
OHP marker pen	Camlin, India	–
ORP-150	ImmunoTag, USA	ITT08329
Pointed sharp edge scissor	Stoelting, Germany	52132-11
Potassium Chloride	Himedia, Mumbai, India	MB043
Potassium phosphate monobasic anhydrous	Himedia, Mumbai, India	MB050
Protease Inhibitor	Abcam, United States	Ab65621
SOD-1	ImmunoTag, USA	ITT4364
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Mumbai, India	27605
Sodium dodecyl sulphate	Himedia, Mumbai, India	GRM886
Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm)	Ramson, India	GS-2029
Stereo Zoom surgical microscope	Olympus, Japan	SZ2-STU3
Syringe discarder	BIOHAZARD	882210
Toothed forceps	Stoelting, Germany	52102-30
Tris Base	G Biosciences, United States	RC1217
Tris Hydrochloric Acid	Himedia, Mumbai, India	MB030
Tween 20	G Biosciences, United States	RC1227
White Leghorn Chicken 0-day eggs	–	–
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK	MP Biomedicals, LLC, USA	FK009