3일간의 병아리 배아를 이용한 후크 허혈-재관류 모델의 생성
Summary
이 논문은 I/R 개발 및 치료를 더 잘 이해하기 위해 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 3 일 간의 병아리 배아에서 허혈 재관류 (I/R) 모델링을 설명합니다. 이 모델은 간단하고 빠르며 저렴합니다.
Abstract
심근 경색, 뇌졸중 및 말초 혈관 질환과 같은 허혈 및 재관류 (I /R) 장애는 질병과 사망의 주요 원인 중 일부입니다. 많은 시험관 및 생체 내 모델은 현재 질병 또는 손상된 조직에서 I/R 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 그러나, 현재까지 , Ovo I/R 모델에서 보고 되었습니다., I/R 메커니즘및 빠른 약물 스크리닝의 더 나은 이해를 허용 할 것 이다. 이 논문은 I/R 개발 및 치료 메커니즘을 이해하기 위해 3일 병아리 배아에서 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 I/R 모델링을 설명합니다. 우리의 모형은 DNA, RNA 및 단백질 수준에 이상을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 간단하고 빠르며 저렴합니다. 현재 모델은 독립적으로 또는 기존 시험관 내 및 생체 내 I/R 모델과 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
허혈 -재관 류 조직 부상은 심장 마비, 허혈성 뇌졸중, 외상 및 말초 혈관 질환을 포함한 여러 병리학에 연결되었습니다1,2,3,4,5. 이것은 주로 질병 진행의 포괄적인 이해의 부족 및 효과적인 연구 모형의 부족 때문입니다. 허혈성 상해는 조직의 특정 지역에 혈액 공급이 끊어질 때 생깁니다. 그 결과, 허혈성 조직은 결국 괴사, 속도는 조직에 따라 달라 집니다. 따라서 혈액 공급을 복원하면 손상을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 경우에는, 그 재관류는 혼자 허혈보다 더 많은 조직 손상을 일으키는 것이 관찰되었습니다6,7,8. 따라서, 허혈-재퍼퓨전의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것은 효과적인 치료 적 개입을 개발하는 데 필요하다. 현재 I/R 부상에 대한 효과적인 치료법은 알려져 있지 않습니다. 이러한 차이로 인해 시험관 내부터 생체 내 모델에 이르는 새로운 실험 모델이 생성되어 기존 문제를 해결했습니다9,10,11,12,13.
병아리 배아 (갈루스 갈루스 국내)는 접근의 용이성, 윤리적 수용성, 상대적으로 큰 크기 (다른 배아에 비해), 저렴한 비용 및 급속한 성장14 때문에 연구에 널리 사용됩니다. 우리는 개발의 72 h에서 병아리 배아를 사용하여 척추 바늘의 도움으로 올바른 비텔린 동맥을 가리고 방출하여 오보 I / R에서 병아리 배아를 만들었습니다. 우리는 후크 I / R 허혈 재관전 모델 (그림 1)을 명명했습니다. 이 연구에서 활용되는 모델은 I/R 손상15,16,17과 자주 연관되는 산화 및 염증 경로를 포함한 모든 다운스트림 프로세스를 정확하게 시뮬레이션할 수 있습니다.
Protocol
에라의 Lucknow 의과 대학 및 병원의 기관 동물 윤리위원회는 동물 실험의 통제 및 감독위원회 (CPCSEA)에 따라 이러한 실험을 수행하기 위해 공식적인 승인이 필요하지 않다는 서면 면제를 발표했다. 그러나, 표준 수술 절차는 배아 고통에 대한 가능성을 최소화하기 위해 따랐다. 1. 버퍼 준비 (표 1) 링거의 솔루션 준비 링거의 용액을 준비하기 위해, NaCl …
Representative Results
도플러 혈류 이미징 기술은 모델의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 요컨대, 우리는 우리의 창조의 성공을 결정하기 위해 RVA 그룹의 데이터와 제어 그룹의 데이터를 비교. 도 4A 는 대조군 동물과 관련된 일반적인 플럭스를 묘사하고 , 도 4B 는 RVA로부터 얻은 결과를 묘사한다. 숫자 1-8은 I/R 단계와 관련된 다양한 이벤트를 나타냅니다. 간단히 말해?…
Discussion
허혈 재퍼퓨전 연구의 목표는 세포 사멸을 방지하고 회복을 촉진하는 치료 전략을 만드는 것입니다29,30. I/R 연구에서 현재의 제약을 극복하기 위해 Hook I/R 병아리 배아 모델을 설계하여 신뢰할 수 있고 재현 가능한 I/R 모델을 생성했습니다. 우리의 지식에, 우리의 것은 이제까지 일상적인 I/R 실험을 위한 3 일 병아리 태아에서 만든 첫번째 I/R 모형입니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비디오 그래피와 편집 중에 그의 중요한 입력에 대한 하리 샨카르에 대한 감사를 표현하고 싶습니다, 음성 해설에 대한 씨 Baqer 후세인, 비디오 촬영을위한 씨 아슈가르 리즈비, 비디오 촬영을위한 씨 모하마드 하이더, 씨 모하마드 덴마크 시디키 실험 하는 동안 도움을.
Materials
| (-80°C) freezer | Haier, China | – | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | – | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | – | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | – | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | – | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | – | – | |
| Egg rack | – | – | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | – | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | – | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | – | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | – | – | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
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Cite This Article
Kumari, N., Yadav, S. K., Prakash, R., Siddiqui, A. J., Khan, M. A., Raza, S. S. Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo. J. Vis. Exp. (180), e63288, doi:10.3791/63288 (2022).