דור של הוק איסכמיה-רפרפוזיה מודל באמצעות שלושה ימים מתפתח אפרוח עובר
Summary
מאמר זה מתאר איסכמיה-reperfusion (I/R) דוגמנות בעובר אפרוח 3 ימים באמצעות מחט עמוד השדרה מותאם אישית וו כדי להבין טוב יותר את התפתחות I / R וטיפול. דגם זה פשוט, מהיר וזול.
Abstract
הפרעות איסכמיה ורפרפוזיה (I/R), כגון אוטם שריר הלב, שבץ ומחלות כלי דם היקפיות, הן חלק מהגורמים המובילים למחלות ומוות. מודלים רבים במבחנה וב-in vivo זמינים כיום לחקר מנגנון ה-I/R במחלות או ברקמות פגומות. עם זאת, עד כה, לא דווח על מודל Ovo I/R, אשר יאפשר הבנה טובה יותר של מנגנוני I/R הקרנת סמים מהירה יותר. מאמר זה מתאר מידול I/R באמצעות וו מותאם אישית של מחט עמוד השדרה בעובר אפרוח בן 3 ימים כדי להבין מנגנוני פיתוח וטיפול במנת מ”ר. המודל שלנו יכול לשמש כדי לחקור אנומליות ברמות ה- DNA, הרנ”א והחלבון. שיטה זו פשוטה, מהירה וזולה. ניתן להשתמש במודל הנוכחי באופן עצמאי או בשילוב עם דגמי הפריה ויטרו קיימים ובדגמי I/R של vivo.
Introduction
פגיעה ברקמת איסכמיה-רפרפוזיה נקשרה למספר פתולוגיות, כולל התקפי לב, שבץ איסכמי, טראומה ומחלות כלי דם היקפיות1,2,3,4,5. זאת בעיקר בשל חוסר הבנה מקיפה של התקדמות המחלה והיעדר מודל מחקר יעיל. פגיעה איסכמית מתרחשת כאשר אספקת הדם לאזור מסוים של הרקמה מנותקת. כתוצאה מכך, רקמה איסכמית בסופו של דבר נמק, אם כי הקצב משתנה בהתאם לרקמה. לפיכך, שיקום אספקת הדם עשוי לעזור למתן את הנזק. עם זאת, נצפתה, במקרים מסוימים, כי רפרופוזיה גורמת יותר נזק לרקמות מאשר איסכמיה לבד עושה 6,7,8. לכן, הבנת המנגנונים המולקולריים והתאים של איסכמיה-רפרפוזיה נדרשת לפתח התערבות טיפולית יעילה. נכון לעכשיו, לא ידוע על טיפול יעיל לפציעות מס 30. פער זה הניע את יצירתם של מודלים ניסיוניים חדשים, החל מהפריה ויטרו ועד דגמי ויוו, כדי לטפל בבעיה הקיימת9,10,11,12,13.
עוברים אפרוח (Gallus gallus domesticus) נמצאים בשימוש נרחב במחקר בגלל קלות הגישה שלהם, מקובלות אתית, גודל גדול יחסית (בהשוואה לעוברים אחרים), עלות נמוכה, וצמיחה מהירה14. השתמשנו בעובר אפרוח בשעה 72 שעות של פיתוח כדי ליצור I/R ovo על ידי חסימת ושחרור העורק vitelline הנכון בסיוע מחט עמוד השדרה. קראנו לו מודל איסכמיה-רפרפוזיה הוק-I/R (איור 1). המודל המשמש במחקר זה מסוגל לדמות במדויק את כל התהליכים במורד הזרם, כולל מסלולים חמצוניים ודלקתיים, הקשורים לעתים קרובות לנזקי I/R15,16,17.
Protocol
הוועדה הממסדית לאתיקה לבעלי חיים במכללה הרפואית ובבית החולים של Era’s Lucknow פרסמה ויתור בכתב לפיו לא נדרש אישור רשמי לביצוע ניסויים אלה בהתאם לוועדה לצורך בקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים (CPCSEA). עם זאת, נהלי הפעלה סטנדרטיים בוצעו כדי למזער כל פוטנציאל למצוקה עוברית. 1. הכנת מ…
Representative Results
טכניקת הדמיית זרימת הדם דופלר שימשה להערכת האפקטיביות של המודל שלנו. בקיצור, השווינו את הנתונים מקבוצת הביקורת עם הנתונים מקבוצת RVA כדי לקבוע את הצלחת היצירה שלנו. איור 4A מתאר שטף אופייני הקשור לחית השליטה, ואילו איור 4B מתאר את התוצאות שהתקבלו מ-RVA. המספר 1-8 מ…
Discussion
מטרת מחקר איסכמיה-רפרפוזיה היא ליצור אסטרטגיות טיפוליות המונעות מוות של תאים ומקדמות התאוששות29,30. כדי להתגבר על האילוצים הנוכחיים במחקר I/R, עיצבנו מודל של עובר של הוק I/R כדי לייצר מודל I/R אמין ושחזורי. למיטב ידיעתנו, מודל ה- I/R הראשון שנוצר אי פעם בעובר אפרוח ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להביע את הכרת התודה שלנו להארי שנקר על התשומות הביקורתיות שלו במהלך צילום וידאו ועריכה, מר בקר חוסיין לקריינות, מר אסגהאר ריזווי לעריכת וידאו, מר מוחמד היידר לצילומי וידאו, מר מוחמד דני סידיקי לסיוע במהלך הניסויים.
Materials
| (-80°C) freezer | Haier, China | – | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | – | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | – | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | – | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | – | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | – | – | |
| Egg rack | – | – | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | – | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | – | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | – | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | – | – | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
- Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034 (2018).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Raza, S. S., et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke. Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).
- Raza, S. S., et al. Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke. Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).
- Raza, S. S., et al. Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats. Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).
- Fan, L., Zhou, L. AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway. Brain and Behavior. 11 (1), 01911 (2021).
- Wu, M. Y., et al. Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury. Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Allen, D. D., et al. Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies. Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).
- Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).
- Huang, K. Y., et al. A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals. BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297 (2016).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: Experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302 (2018).
- Seabra, R., Bhogal, N. In vivo research using early life stage models. In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).
- Liu, H., et al. Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta. Experiments in Neurology. 329, 113302 (2020).
- Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).
- Wallert, M., et al. alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury. Redox Biology. 26, 101292 (2019).
- Ashafaq, M., et al. Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia. Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
- Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (107), e53329 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Wu, Y., et al. Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75 (2020).
- Franke, M., et al. The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Behaviour and Immunity. 92, 223 (2021).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651 (2009).
- Liu, H., et al. Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation. Frontiers in Immunology. 10, 2408 (2009).
- Prakash, R., et al. Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700 (2021).
- Prakash, R., et al. Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway – implications for neurotransplantations. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Ahmad, A., et al. Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).
- Guan, X., et al. The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation. Life Science. 235, 116795 (2019).
- Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452 (2019).
- Wainrach, S., Sotelo, J. R. Electron microscope study of the developing chick embryo heart. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).
- Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes. Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model. Teratology. 7, 22-23 (1973).
- Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of ischemia-reperfusion injury. Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
- Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686 (2020).
- Bromage, D. I., et al. Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis. Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).
- Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo. Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).
- Rezzola, S., et al. angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform. Frontiers in Immunology. 11, 581288 (2020).
Cite This Article
Kumari, N., Yadav, S. K., Prakash, R., Siddiqui, A. J., Khan, M. A., Raza, S. S. Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo. J. Vis. Exp. (180), e63288, doi:10.3791/63288 (2022).