Este artigo descreve a modelagem isquemia-reperfusão (I/R) em um embrião de 3 dias usando um gancho personalizado de agulha espinhal para entender melhor o desenvolvimento e o tratamento da I/R. Este modelo é simples, rápido e barato.
Distúrbios de isquemia e reperfusão (I/R), como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e doença vascular periférica, são algumas das principais causas de doença e morte. Muitos modelos in vitro e in vivo estão atualmente disponíveis para estudar o mecanismo de I/R em doenças ou tecidos danificados. No entanto, até o momento, nenhum modelo de I/R de ovo foi relatado, o que permitiria uma melhor compreensão dos mecanismos de I/R e uma triagem mais rápida de medicamentos. Este artigo descreve a modelagem de I/R usando um gancho personalizado de agulha espinhal em um embrião de 3 dias para entender os mecanismos de desenvolvimento e tratamento de I/R. Nosso modelo pode ser usado para investigar anomalias nos níveis de DNA, RNA e proteína. Este método é simples, rápido e barato. O modelo atual pode ser usado de forma independente ou em conjunto com os modelos in vitro e in vivo I/R existentes.
A lesão tecidual isquemia-reperfusão tem sido associada a uma série de patologias, incluindo ataques cardíacos, acidente vascular cerebral isquêmico, trauma e doença vascular periférica1,2,3,4,5. Isso se deve principalmente à falta de uma compreensão abrangente da progressão da doença e à falta de um modelo de pesquisa eficaz. A lesão isquêmica ocorre quando o suprimento de sangue para uma área específica do tecido é cortado. Como resultado, o tecido isquêmico eventualmente necrosa, embora a taxa varie dependendo do tecido. Assim, restaurar o suprimento de sangue pode ajudar a mitigar os danos. No entanto, tem sido observado, em alguns casos, que a reperfusão causa mais danos teciduais do que a isquemia sozinha faz 6,7,8. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares e celulares da isquemia-reperfusão é necessária para desenvolver uma intervenção terapêutica eficaz. Atualmente, não se sabe nenhum tratamento eficaz para lesões de I/R. Essa disparidade levou à criação de novos modelos experimentais, que vão desde modelos in vitro até in vivo, para resolver o problema existente9,10,11,12,13.
Os embriões de filhotes (Gallus gallus domesticus) são amplamente utilizados em pesquisas devido à sua facilidade de acesso, aceitabilidade ética, tamanho relativamente grande (em comparação com outros embriões), baixo custo e rápido crescimento14. Utilizamos um embrião de pintinho a 72 h de desenvolvimento para criar um em ovo I/R octurando e liberando a artéria vitelline direita com a ajuda de uma agulha espinhal. Nós o chamamos de modelo de isperfusão de isquemia de Gancho-I/R (Figura 1). O modelo utilizado neste estudo é capaz de simular com precisão todos os processos a jusante, incluindo vias oxidativas e inflamatórias, frequentemente associadas a danos de I/R15,16,17.
O objetivo da pesquisa isquemia-reperfusão é criar estratégias terapêuticas que previnem a morte celular e promovam a recuperação 29,30. Para superar as restrições atuais na pesquisa de I/R, projetamos um modelo de embrião de pintinhos Hook I/R para produzir um modelo de I/R confiável e reprodutível. Para nosso conhecimento, o nosso é o primeiro modelo de I/R já criado em um embrião de 3 dias para experimentos de I/R de rotina, além de estudar sina…
The authors have nothing to disclose.
Queremos expressar nossa gratidão a Hari Shankar por suas contribuições críticas durante a videografia e edição, Sr. Baqer Hussain por dublagem, Sr. Asghar Rizvi para edição de vídeo, Sr. Mohammad Haider para filmagens, Sr. Mohammad Dinamarquês Siddiqui para assistência durante os experimentos.
(-80°C) freezer | Haier, China | – | |
1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
1mL Syringe | DISPO VAN | – | |
26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
50mL Beaker | TARSONS, India | – | |
5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | – | |
Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | – | |
Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
Egg rack | – | – | |
Egg rack | – | – | |
GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
Kidney tray | HOSPITO | – | |
LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
Nose plier | Local made, Lucknow, India | – | |
Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
OHP marker pen | Camlin, India | – | |
ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
White Leghorn Chicken 0-day eggs | – | – | |
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |