Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen
Summary
Het protocol maakt het mogelijk om een zuivere adipocytenpopulatie te genereren uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s). Retinoïnezuur wordt gebruikt om iPSC’s te differentiëren in mesenchymale stamcellen (MSC’s) die worden gebruikt voor de productie van adipocyten. Vervolgens wordt een sorteerbenadering op basis van Nijlrode kleuring gebruikt om zuivere adipocyten te verkrijgen.
Abstract
Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie hebben het genereren van verschillende celtypen mogelijk gemaakt, waaronder adipocyten. De huidige differentiatiemethoden hebben echter een lage efficiëntie en produceren geen homogene populatie van adipocyten. Hier omzeilen we dit probleem door een volledig trans-retinoïsche methode te gebruiken om mesenchymale stamcellen (MSC’s) met een hoge opbrengst te produceren. Door routes te reguleren die celproliferatie, overleving en adhesie regelen, maakt onze differentiatiestrategie de efficiënte generatie van embryonale lichamen (EB’s) mogelijk die differentiëren in een zuivere populatie van multipotente MSC’s. Het grote aantal MSC’s dat door deze methode wordt gegenereerd, biedt een ideale bron voor het genereren van adipocyten. De heterogeniteit van de steekproef als gevolg van adipocytendifferentiatie blijft echter een uitdaging. Daarom gebruikten we een op Nijlrood gebaseerde methode voor het zuiveren van lipide-dragende volwassen adipocyten met behulp van FACS. Deze sorteerstrategie stelde ons in staat om een betrouwbare manier te vinden om adipocyten-geassocieerde metabole stoornissen te modelleren met behulp van een pool van adipocyten met verminderde heterogeniteit van het monster en verbeterde celfunctionaliteit.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC’s) fungeren als een effectieve tijdelijke bron voor het produceren van cellen van mesodermale oorsprong zoals adipocyten, osteocyten en chondrocyten, die verder kunnen worden gebruikt voor het modelleren van hun respectieve genetische aandoeningen. Eerdere benaderingen waren echter gebaseerd op het bereiken van deze MSC’s uit volwassen weefsels 1, wat de uitdaging oplegde om ze in grote aantallen van de donoren te verkrijgen, en de beperking om ze functioneel levensvatbaar te houden in suboptimale in vitro kweekomstandigheden 1,2. Deze obstakels hebben geleid tot een grote vraag naar een protocol voor het genereren van MSC’s in vitro. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) kunnen worden gebruikt als een waardevolle bron van MSC’s en vertonen MSC-kenmerken 3,4,5. iPSCS-afgeleide MSC’s kunnen worden gebruikt als een therapeutische optie bij verschillende ziekten. Ook het vermogen van van iPSC’s afgeleide MSC’s om adipocyten te genereren, maakt ze een waardevol in vitro menselijk model om menselijke adipogenese, obesitas en adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen.
De huidige differentiatieprotocollen van adipocyten kunnen in twee groepen worden ingedeeld, waarbij de ene differentiatie van adipocyten met behulp van chemische of op eiwitten gebaseerde cocktails met een resulterende opbrengst van 30% -60% 6,7,8,9 oplevert, terwijl de andere genetische manipulatie omvat voor robuuste inductie van belangrijke transcriptiefactoren die de ontwikkeling van adipocyten regelen om een opbrengst van 80% -90% 10 te geven, 11. Genetische manipulatie vat echter niet het natuurlijke proces van adipocytendifferentiatie samen en maskeert vaak de subtiele paradigma’s die tijdens adipogenesis aankomen, waardoor het niet effectief is voor ziektemodelleringsdoeleinden12,13. Daarom presenteren we een manier om chemisch afgeleide volwassen adipocyten te sorteren van onrijpe adipocyten door fluorescerend lipide-dragende adipocyten te labelen met behulp van Nijlrood.
Hier presenteren we een protocol met voorbijgaande incubatie van van iPSC’s afgeleide embryoïde lichamen (EB’s) met all-trans retinoïnezuur om een groot aantal snel prolifererende MSC’s te produceren, die verder kunnen worden gebruikt voor het genereren van adipocyten14. We presenteren ook een manier om chemisch afgeleide rijpe adipocyten uit de heterogene differentiatiepool te sorteren door hun lipidedruppeltjes fluorescerend te labelen met behulp van een lipofiele kleurstof; Nijlrood. Dit zou het mogelijk maken om een zuivere populatie van volwassen adipocyten te genereren met verbeterde functionaliteit om adipocyt-geassocieerde metabole stoornissen nauwkeurig te modelleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is van het grootste belang vanwege het vermogen om MSC’s met een hoge opbrengst en efficiëntie te leveren. Deze massaproductie van MSC’s werd mogelijk gemaakt door tijdelijke incubatie van van iPSC’s afgeleide EB’s met 10 μM RA14,15. Voorbijgaande behandeling met 10 μM RA verhoogde de MSC-opbrengst met 11,2 tot 1542 maal14,15, waarbij dit protocol van toepassing was op zowel iPSC’s als hPS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi werd ondersteund door een GSRA-beurs van het Qatar National Research Fund (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
