Différenciation robuste des CSPi humaines en une population pure d’adipocytes pour étudier les troubles associés aux adipocytes

Summary

Le protocole permet la génération d’une population adipocytaire pure à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). L’acide rétinoïque est utilisé pour différencier les CSPi en cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sont utilisées pour produire des adipocytes. Ensuite, une approche de tri basée sur la coloration rouge du Nil est utilisée pour obtenir des adipocytes purs.

Abstract

Les progrès récents de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la génération de différents types de cellules, y compris les adipocytes. Cependant, les méthodes de différenciation actuelles ont une faible efficacité et ne produisent pas une population homogène d’adipocytes. Ici, nous contournons ce problème en utilisant une méthode entièrement trans basée sur les rétinoïques pour produire des cellules souches mésenchymateuses (CSM) à haut rendement. En régulant les voies régissant la prolifération, la survie et l’adhésion cellulaires, notre stratégie de différenciation permet la génération efficace de corps embryonnaires (EB) qui se différencient en une population pure de CSM multipotentes. Le nombre élevé de CSM générées par cette méthode constitue une source idéale pour la génération d’adipocytes. Cependant, l’hétérogénéité des échantillons résultant de la différenciation des adipocytes reste un défi. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode à base de rouge du Nil pour purifier les adipocytes matures lipidiques à l’aide de FACS. Cette stratégie de tri nous a permis d’établir un moyen fiable de modéliser les troubles métaboliques associés aux adipocytes à l’aide d’un pool d’adipocytes avec une hétérogénéité d’échantillon réduite et une fonctionnalité cellulaire améliorée.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) agissent comme une ressource transitoire efficace pour produire des cellules d’origine mésodermique comme les adipocytes, les ostéocytes et les chondrocytes, qui pourraient être utilisées pour modéliser leurs troubles génétiques respectifs. Cependant, les approches précédentes reposaient sur l’obtention de ces CSM à partir de tissus adultes 1, ce qui imposait le défi de les obtenir en grand nombre auprès des donneurs et la limitation de leur viabilité fonctionnelle dans des conditions de culture in vitro sous-optimales ^1,2. Ces obstacles ont produit une grande demande d’avoir un protocole pour générer des CSM in vitro. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) peuvent être utilisées comme source précieuse de CSM, présentant les caractéristiques^des CSM ^3,4,5. Les CSM dérivées des CSPi peuvent être utilisées comme option thérapeutique dans plusieurs maladies. En outre, la capacité des CSM dérivées des CSPi à générer des adipocytes en fait un modèle humain in vitro précieux pour étudier l’adipogenèse humaine, l’obésité et les troubles associés aux adipocytes.

Les protocoles actuels de différenciation des adipocytes peuvent être classés en deux groupes, l’un impliquant la différenciation des adipocytes à l’aide de cocktails chimiques ou à base de protéines donnant un rendement résultant de 30%-60%6,7,8,9, tandis que l’autre impliquant une manipulation génétique pour une induction robuste de facteurs de transcription clés régissant le développement des adipocytes pour donner un rendement de 80%-90%^{10, 11}. Cependant, la manipulation génétique ne récapitule pas le processus naturel de différenciation des adipocytes et masque souvent les paradigmes subtils arrivant au cours de l’adipogenèse, ce qui la rend inefficace à des fins de modélisation de la maladie^12,13. Par conséquent, nous présentons un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement des adipocytes immatures en marquant par fluorescence les adipocytes lipidiques à l’aide de rouge du Nil.

Nous présentons ici un protocole impliquant l’incubation transitoire de corps embryoïdes (EB) dérivés de CSPi avec de l’acide rétinoïque tout-trans pour produire un grand nombre de CSM à prolifération rapide, qui pourraient être utilisés pour générer des adipocytes¹⁴. Nous présentons également un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement du pool de différenciation hétérogène en marquant par fluorescence leurs gouttelettes lipidiques à l’aide d’un colorant lipophile; Nil rouge. Cela permettrait la génération d’une population pure d’adipocytes matures avec une fonctionnalité améliorée pour modéliser avec précision les troubles métaboliques associés aux adipocytes.

Protocol

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du HMC (n° 16260/16) et de l’ICRQ (n° 2016-003). Ce travail est également optimisé pour les CSEh tels que H1 et H9. Des échantillons de sang ont été prélevés sur d…

Representative Results

Schéma et morphologie des cellules au cours de la différenciation mésenchymateuse : La différenciation des CSPi en CSM implique différents stades de développement allant de la formation de l’EB, de la différenciation des CSM et de l’expansion des CSM (Figure 1). Au cours de ces stades de développement, les cellules acquièrent une morphologie variée en raison des différents produits chimiques stimulants auxquels elles sont soumises. Lors du début de la différenciation, les ce…

Discussion

Ce protocole revêt une importance primordiale en raison de sa capacité à fournir des CSM à haut rendement et efficacité. Cette production à grande échelle de CSM a été rendue possible par l’incubation transitoire de SE dérivés de CSPi avec 10 μM de RA^14,15. Le traitement transitoire avec 10 μM de PR a augmenté le rendement des CSM de 11,2 à 1542 fois^14,15, ce protocole étant applicable ?…

Materials

Adiponectin	Abcam	ab22554	Adipocyte maturation marker
anti-CD105	BD Pharmingen	560839	MSC differentiation marker
anti-CD14	BD Pharmingen	561712	MSC differentiation marker
anti-CD19	BD Pharmingen	555415	MSC differentiation marker
anti-CD34	BD Pharmingen	555824	MSC differentiation marker
anti-CD44	abcam	ab93758	MSC differentiation marker
anti-CD45	BD Pharmingen	560975	MSC differentiation marker
anti-CD73	BD Pharmingen	550256	MSC differentiation marker
anti-CD90	BD Pharmingen	555596	MSC differentiation marker
bFGF	R&D	233-FP	MSC culture media supplement
C/EBPA	Abcam	ab40761	Adipocyte maturation marker
Dexamethasone	Torics	1126	Adipocyte differentiation media supplement
FABP4	Abcam	ab93945	Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum	ThermoFisher	10082147	MSC culture media supplement
Glutamax	ThermoFisher	35050-061	MSC culture media supplement
IBMX	Sigma Aldrich	I5879	Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin	Sigma Aldrich	I7378	Adipocyte differentiation media supplement
Insulin	Sigma Aldrich	91077C	Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM	ThermoFisher	12660012	Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM	ThermoFisher	11885084	MSC culturing media
Matrigel	Corning	354230	Coating matrix
MEM-alpha	ThermoFisher	12561056	Adipocyte differentiation media
Nilered	Sigma Aldrich	19123	Sorting marker for adipocyte
Penicillin	ThermoFisher	15140122	MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190144	wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer	Thermo Fisher	28358	wash buffer
PPARG	Cell Signaling Technology	2443	Adipocyte maturation marker
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	Dissociation reagent
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625	MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor	Tocris	1254/10	hPSC culture media supplement
Roziglitazone	Sigma Aldrich	R2408	Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex	ThermoFisher	A334901	hPSC culture media
Triton	Thermo Fisher	28314	Permebealization reagent
Trypsin	ThermoFisher	25200072	Dissociation reagent
Tween 20	Sigma Aldrich	P7942	Wash buffer