Робастная дифференциация ИПСК человека в чистую популяцию адипоцитов для изучения адипоцит-ассоциированных заболеваний
Summary
Протокол позволяет генерировать чистую популяцию адипоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Ретиноевая кислота используется для дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые используются для производства адипоцитов. Затем для получения чистых адипоцитов используется подход сортировки, основанный на окрашивании Нила в красный цвет.
Abstract
Последние достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволили генерировать различные типы клеток, включая адипоциты. Однако современные методы дифференцировки имеют низкую эффективность и не дают однородной популяции адипоцитов. Здесь мы обходим эту проблему, используя полностью транс-ретиноевый метод для получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с высоким выходом. Регулируя пути, регулирующие пролиферацию, выживание и адгезию клеток, наша стратегия дифференцировки позволяет эффективно генерировать эмбриональные тела (БЭ), которые дифференцируются в чистую популяцию мультипотентных МСК. Большое количество МСК, генерируемых этим методом, является идеальным источником для генерации адипоцитов. Однако гетерогенность образца в результате дифференцировки адипоцитов остается проблемой. Поэтому мы использовали метод очистки липидсодержащих зрелых адипоцитов на основе нильского краса с помощью FACS. Эта стратегия сортировки позволила нам установить надежный способ моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами, с использованием пула адипоцитов с уменьшенной гетерогенностью образца и улучшенной функциональностью клеток.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) действуют как эффективный транзиторный ресурс для производства клеток мезодермального происхождения, таких как адипоциты, остеоциты и хондроциты, которые в дальнейшем могут быть использованы для моделирования соответствующих генетических нарушений. Однако предыдущие подходы основывались на получении этих МСК из тканей взрослого человека 1, что создавало проблему получения их в больших количествах от доноров и ограничение их функциональной жизнеспособности в неоптимальных условиях культивирования in vitro 1,2. Эти препятствия породили большой спрос на протокол для генерации МСК in vitro. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) могут быть использованы в качестве ценного источника МСК, проявляя характеристикиМСК 3,4,5. МСК, полученные из ИПСК, могут использоваться в качестве терапевтического варианта при нескольких заболеваниях. Кроме того, способность МСК, полученных из ИПСК, генерировать адипоциты, делает их ценной моделью человека in vitro для изучения адипогенеза человека, ожирения и заболеваний, связанных с адипоцитами.
Современные протоколы дифференцировки адипоцитов можно разделить на две группы, одна из которых включает дифференцировку адипоцитов с использованием химических или белковых коктейлей, дающих результирующий выход 30%-60%6,7,8,9, а другая включает генетические манипуляции для надежной индукции ключевых факторов транскрипции, регулирующих развитие адипоцитов, чтобы дать выход 80%-90%10, 11. Однако генетические манипуляции не повторяют естественный процесс дифференцировки адипоцитов и часто маскируют тонкие парадигмы, возникающие во время адипогенеза, что делает его неэффективным для целей моделирования заболеваний12,13. Таким образом, мы представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов от незрелых путем флуоресцентной маркировки липидсодержащих адипоцитов с использованием нильского красного.
Здесь мы представляем протокол, включающий транзиторную инкубацию эмбриоидных тел (БЭ), полученных из ИПСК, с полностью транс-ретиноевой кислотой для получения большого количества быстро пролиферирующих МСК, которые в дальнейшем могут быть использованы для получения адипоцитов14. Мы также представляем способ сортировки химически полученных зрелых адипоцитов из пула гетерогенной дифференцировки путем флуоресцентной маркировки их липидных капель с использованием липофильного красителя; Нил красный. Это позволило бы создать чистую популяцию зрелых адипоцитов с расширенной функциональностью для точного моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол имеет первостепенное значение из-за его способности обеспечивать высокую производительность и эффективность МСК. Это массовое производство МСК стало возможным благодаря переходной инкубации ЭБ, полученных из ИПСК, с 10 мкМ RA14,15. Транзиторн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No NPRP10-1221-160041). Марьям Агади получила стипендию GSRA от Катарского национального исследовательского фонда (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
References
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
