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Developmental Biology

脂肪細胞関連疾患を研究するためのヒトiPS細胞を純粋な脂肪細胞集団に確実に分化させる(英語)

Published: February 09, 2022
doi:
10.3791/63311
, ,
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI),Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences,Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

このプロトコルにより、人工多能性幹細胞(iPSC)から純粋な脂肪細胞集団を作製することができます。レチノイン酸は、iPS細胞を脂肪細胞の産生に使用される間葉系幹細胞(MSC)に分化させるために使用されます。次に、ナイルレッド染色に基づくソーティングアプローチを使用して、純粋な脂肪細胞を取得します。

Abstract

人工多能性幹細胞(iPSC)技術の最近の進歩により、脂肪細胞を含むさまざまな種類の細胞の生成が可能になりました。しかしながら、現在の分化方法は効率が低く、脂肪細胞の均質な集団を産生しない。ここでは、オールトランスレチノインベースの方法を使用して間葉系幹細胞(MSC)を高収率で製造することにより、この問題を回避します。細胞の増殖、生存、接着を支配する経路を調節することにより、私たちの分化戦略は、多能性MSCの純粋な集団に分化する胚体(EB)の効率的な生成を可能にします。この方法によって生成される多数のMSCは、脂肪細胞を生成するための理想的な供給源を提供します。しかしながら、脂肪細胞の分化に起因するサンプルの不均一性は依然として課題である。そこで、FACSを用いた脂質含有成熟脂肪細胞の精製にはナイルレッドベースの法を用いた。このソーティング戦略により、サンプルの不均一性を低減し、細胞機能を強化した脂肪細胞のプールを使用して、脂肪細胞関連の代謝障害をモデル化する信頼性の高い方法を確立することができました。

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などの中胚葉起源の細胞を産生するための効果的な一時的なリソースとして機能し、それぞれの遺伝性疾患のモデリングにさらに使用できます。しかし、以前のアプローチでは、これらのMSCを成体組織から得ることに依存しており1、ドナーから大量に入手するという課題と、最適ではないin vitro培養条件で機能的に生存し続けるという限界がありました1,2。これらの障害は、in vitroでMSCを生成するためのプロトコルを有するという大きな要求を生み出している。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、MSCの特徴を示すMSCの貴重な供給源として使用することができます3,4,5。iPS細胞由来の間葉系幹細胞は、いくつかの疾患の治療選択肢として使用できます。また、iPS細胞由来のMSCは脂肪細胞を生成する能力があるため、ヒトの脂肪生成、肥満、および脂肪細胞関連疾患を研究するための貴重なin vitroヒトモデルになります。

脂肪細胞の現在の分化プロトコルは2つのグループに分類でき、1つは化学的またはタンパク質ベースのカクテルを使用した脂肪細胞の分化を含み、結果として得られる収量は30%-60%6,7,8,9であり、もう1つは脂肪細胞の発生を支配する主要な転写因子の堅牢な誘導のための遺伝子操作を含み、80%-90%の収量をもたらします10。11.しかし、遺伝子操作は脂肪細胞分化の自然な過程を再現せず、脂肪生成中に到着する微妙なパラダイムを隠すことが多く、疾患モデリングの目的には効果がありません12,13。そこで、ナイルレッドを用いて脂質を含む脂肪細胞に蛍光タグを付けることで、化学的に由来した成熟脂肪細胞と未成熟脂肪細胞を選別する方法を提示します。

ここでは、iPS細胞由来の胚様体(EB)をオールトランス レチノイン酸と一過性インキュベートして、脂肪細胞の生成にさらに使用できる多数の急速に増殖するMSCを生成するプロトコルを紹介します14。また、親油性色素を使用して脂肪滴に蛍光タグを付けることにより、化学的に誘導された成熟脂肪細胞を不均一な分化プールから選別する方法も紹介します。ナイルレッド。これにより、脂肪細胞関連代謝障害を正確にモデル化するための機能が強化された成熟脂肪細胞の純粋な集団の生成が可能になります。

Protocol

この研究は、適切な機関研究倫理委員会によって承認され、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改正または同等の倫理基準に定められた倫理基準に従って実施されています。このプロトコルは、HMC(番号16260/16)およびQBRI(番号2016-003)の治験審査委員会(IRB)によって承認されました。この作業は、H1やH9などのhESCにも最適化されています。血液サンプルは、完全なインフォームドコンセントで?…

Representative Results

間葉系分化における細胞の概略と形態:iPS細胞から間葉系幹細胞への分化には、EB形成、MSC分化、MSC増殖にまたがるさまざまな発生段階があります(図1)。発生のこれらの段階で、細胞は、それらが受ける異なる刺激化学物質のために様々な形態を獲得する。分化を開始すると、細胞は懸濁液に播種され、直径が小から中のサイズでありながら、明確な細胞境界を持つ円形?…

Discussion

このプロトコルは、MSCを高い収率と効率で提供できるため、最も重要です。このMSCの大量生産は、iPS細胞由来EBと10 μMのRA14,15との一過性インキュベーションによって可能になりました。10 μMのRAによる一過性治療は、MSC収量を11.2〜1542倍に増加させ14,15、このプロトコルはiPS細胞とhPSCの両方に適用できま?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、カタール国立研究基金(QNRF)からの助成金によって資金提供されました(助成金番号NPRP10-1221-160041)。マリアム・アガディは、カタール国立研究基金(QNRF)からのGSRA奨学金の支援を受けました。

Materials

Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer
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References

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Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).
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